牛媛媛，汪龍德，毛蘭芳，胥文娟，張 萍，符博雅

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000，2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，甘肅 蘭州 730020，3.甘肅省中醫(yī)院針灸科，甘肅 蘭州 730050）

肝纖維化是肝臟應(yīng)對(duì)組織損傷后自我調(diào)節(jié)性的保護(hù)反應(yīng)，被認(rèn)為是慢性肝病發(fā)展到肝硬化、肝癌、甚至肝衰竭的前期可控階段，現(xiàn)已成為各種急慢性肝病診斷治療的重點(diǎn)關(guān)注事件。公認(rèn)的肝纖維化發(fā)病機(jī)制為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 產(chǎn)生過度與降解不及時(shí)的動(dòng)態(tài)平衡受擾，在肝組織竇周間隙內(nèi)進(jìn)行性形成病理堆積［1-2］。若感染、病毒、寄生蟲等因素持續(xù)存在，肝纖維化可進(jìn)一步惡化為肝癌、肝衰竭等晚期肝病事件，因此抗纖維化的基礎(chǔ)研究對(duì)于臨床治療疾病具有積極意義，同時(shí)也是當(dāng)前肝病領(lǐng)域的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

課題組前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，化瘀軟肝膠囊立法契合本病病位在肝，涉及脾腎的病位概括，尤其在改善患者的乏力、上腹脹滿、惡心、嘔吐、納差等臨床癥狀方面具有顯著優(yōu)勢(shì)［3-6］。此外，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，該方藥能夠有效地調(diào)節(jié)纖維化的四項(xiàng)指標(biāo)及促纖維化細(xì)胞因子，并對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠顯示出良好的纖維化改善效果。然而由于肝纖維化的復(fù)雜致病性及研究單個(gè)細(xì)胞因子的局限性，目前對(duì)于該方藥論治肝纖維化的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。因此，本研究借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)手段，預(yù)測(cè)該中藥復(fù)方抗肝纖維化的活性組分、靶標(biāo)蛋白與信號(hào)通路，進(jìn)一步結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，通過構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，分析該藥物治療肝纖維化的深層原理以及相關(guān)信號(hào)途徑的參與情況，以期為該制劑臨床潛在應(yīng)用價(jià)值的開發(fā)提供理論參考，同時(shí)也為后續(xù)進(jìn)行更深層次的實(shí)驗(yàn)研究提供支持。

1 材料

1.1 藥物 化瘀軟肝膠囊（原名化纖保肝方，由醋鱉甲、龜板、柴胡、枳殼、丹參、赤芍、炒白術(shù)組成），由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供。陽性對(duì)照藥物秋水仙堿（規(guī)格0.5 mg／片，國(guó)字準(zhǔn)藥H53021369，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司）。

1.2 動(dòng)物 40 只SD 大鼠，體質(zhì)量（180±20） g，雄性，購(gòu)自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘） 2018-0003，動(dòng)物合格證號(hào)62000800000058］。飼養(yǎng)條件為溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3 試劑 LC3B、Beclin 1、Akt、p-Akt、GAPDH 一抗（美國(guó)ImmunoWay 公司，貨號(hào)B8101、B2601、YT0178、YP006、B1501）；α-SMA 一抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào) GB11044）；mTOR、p-mTOR 一抗 （美國(guó)GeneTex 公司，貨號(hào)GTX132803、GTX101557）；山羊抗IgG二抗（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab6721）。

1.4 儀器 Eclipse Ci-L 型顯微鏡（日本Nikon 公司）；PANNORAMIC DESK／MIDI／250／1000 型全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH 公司）；DYCZ-40G 型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；5424R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 化瘀軟肝膠囊活性成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù) （https：／／tcmspw.com／tcmsp.php） 和BATMAN 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：／／bionet.ncpsb.org.cn／batmantcm／index.php），以“鱉甲”“龜板” “柴胡” “枳殼” “丹參” “赤芍” “炒白術(shù)” 為關(guān)鍵詞，生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)，檢索化瘀軟肝膠囊活性成分。

2.1.2 預(yù)測(cè)化瘀軟肝膠囊作用靶點(diǎn)與肝纖維化疾病靶點(diǎn)采用TCMSP、BATMAN 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行藥物成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，將所得結(jié)果存入“target.txt” 文件。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將所選的靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)稱，刪除重復(fù)或不匹配的基因名，得到“alltargetSymbol.txt” 基因注釋文件。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù) （http：／／www.genecards.org／），OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／omim.org／） 檢索“hepatic fibrosis” 相關(guān)信息，得到“Disease.txt” 疾病基因文件，構(gòu)建藥物與疾病靶點(diǎn)交集，獲得化瘀軟肝膠囊與肝纖維化的交集靶點(diǎn)文件“Drug-Disease”。

2.1.3 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò) 將“2.1.2”項(xiàng)中篩選得到的藥物和疾病的交集基因輸入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖，借助cytoNCA 插件進(jìn)行分析，同時(shí)通過相應(yīng)的type 文件來標(biāo)注節(jié)點(diǎn)屬性，對(duì)于能夠起到治療作用的藥物分子，則調(diào)整輸出為molLists 文件。

2.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將“2.1.3” 項(xiàng)獲得的藥物-疾病交集靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 11.0 軟件（http：／／string-db.org），并將物種限定為“homosapiens”。選取置信度高于0.95 的數(shù)據(jù)，構(gòu)建化瘀軟肝膠囊的蛋白相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)的連通性、節(jié)點(diǎn)度等指標(biāo)來評(píng)判相關(guān)基因的重要性；基于網(wǎng)絡(luò)中基因與鄰接基因的數(shù)目，準(zhǔn)確篩選出擁有最多鄰接基因的幾個(gè)基因，這些基因即為目標(biāo)核心基因。

2.1.5 GO 和KEGG 富集分析 將上述PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白匯總，使用R 語言bioconductor 包 （http：／／www.bioconductor.org／） 分別進(jìn)行GO 功能分析與KEGG 通路富集分析，篩選結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組（6 只） 與造模組（34 只），造模組參考文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道，采用復(fù)雜多因素方法復(fù)制肝纖維化大鼠模型。大鼠皮下注射40%四氯化碳（CCl4） 花生油溶液，首次注射量為0.5 mL／100 g，之后每次注射量為0.3 mL／100 g，每周2 次，持續(xù)8 周，同時(shí)給予高脂飼料和5%乙醇溶液；空白組大鼠則自由飲食（普通飼料）、飲水（純水）。第8 周末，隨機(jī)選取并處死模型組大鼠4 只，取出肝臟組織進(jìn)行HE 染色、天狼猩紅染色及病理程度評(píng)分，評(píng)價(jià)模型復(fù)制是否成功。

2.2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、秋水仙堿組和化瘀軟肝膠囊低、中、高劑量組，每組6 只。各組大鼠給藥劑量參照人與動(dòng)物按體表面積折算［8］，即化瘀軟肝膠囊低、中、高劑量組灌胃給予0.031 5、0.063 0、0.094 5 g／mL （臨床等效劑量的0.5、1、1.5 倍）化瘀軟肝膠囊混懸液；秋水仙堿組灌胃給予0.2 mg／kg 秋水仙堿混懸液；空白組和模型灌胃給予1 mL／100 g 生理鹽水，每天1 次，連續(xù)6 周。

2.2.3 取材與指標(biāo)檢測(cè) 給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射（1 mL／100 g） 進(jìn)行麻醉，充分暴露腹腔，生理鹽水肝臟灌注，肉眼觀察組織變化為灰白色即可，取肝左葉外1／4 組織于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)病理變化，采用Metavir 評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)肝組織纖維化程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。Western blot 法檢測(cè)肝組織p-Akt／Akt、p-mTOR／mTOR、Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)。免疫熒光染色法檢測(cè)肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)。

表1 Metavir 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)選擇LSD 法，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3 法；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 化瘀軟肝膠囊活性成分篩選 通過TCMSP、BATMAN 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到化瘀軟肝膠囊活性成分128 個(gè)，其中柴胡17 個(gè)，赤芍29 個(gè)，枳殼5 個(gè)，丹參65 個(gè)，鱉甲1 個(gè)，龜板6 個(gè)，炒白術(shù)5 個(gè)。

3.1.2 化瘀軟肝膠囊與肝纖維化交集基因 經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋后得到化瘀軟肝膠囊活性成分靶點(diǎn)注釋基因558 個(gè)；通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到5 301 個(gè)與肝纖維化相關(guān)的基因，取化瘀軟肝膠囊與疾病的交集靶點(diǎn)，共獲得367 個(gè)交集基因，見圖1。

圖1 藥物成分與疾病的交集基因

3.1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.7.2 繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病” 網(wǎng)絡(luò)圖，共含有664個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 106 條邊，涉及98 種活性成分和藥物與疾病共有靶點(diǎn)367 個(gè)。通過CytoNCA 分析發(fā)現(xiàn)化瘀軟肝膠囊排名前十的活性成分為苯丙氨酸、槲皮素、甲硫氨酸、β-谷甾醇、天冬氨酸、亮氨酸、豆甾醇、山柰酚、木犀草素、丹參酮ⅡA。

3.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，將結(jié)果導(dǎo)出并輸入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，得出PPI 網(wǎng)絡(luò)共23 個(gè)節(jié)點(diǎn)，111 條邊，其中度值排名前十的靶蛋白為STAT3、JUN、MAPK1、MAPK3、TP53、IL6、RELA、TNF、FOS、MYC。

圖2 化瘀軟肝膠囊-肝纖維化共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

3.1.5 GO 富集分析 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入R 語言bioconductor 包中，分別進(jìn)行分子功能（molecular functions，MF）、生物途徑功能（biological processes，BP）、細(xì)胞成分（cellular components，CC） 富集分析，取排名前十的條目制作條形圖，見圖3?？梢姲悬c(diǎn)蛋白分子功能主要體現(xiàn)在兒茶酚胺鍵合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性，轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體活性配體激活、有機(jī)酸結(jié)合、羧酸結(jié)合等方面；細(xì)胞成分主要包含囊腔、突觸后膜、質(zhì)膜筏、小凹、膜微結(jié)構(gòu)域等；生物過程主要涉及活性氧代謝過程、腺發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)菌源分子反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)等途徑。

圖3 “化瘀軟肝膠囊-肝纖維化” 共同靶點(diǎn)的GO 分析

3.1.6 KEGG 通路分析 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入R 語言bioconductor 包中，選取P值較小，count 數(shù)較大的前30條通路，利用氣泡圖進(jìn)行可視化，見圖4，由此可知，化瘀軟肝膠囊干預(yù)肝纖維化的作用途徑主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等。

圖4 “化瘀軟肝膠囊-肝纖維化” 共同靶點(diǎn)的KEGG 分析

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3.2.1 化瘀軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠膠原纖維的影響 光鏡下觀察血管壁膠原纖維呈紅色，細(xì)胞核呈綠色，其他成分呈黃色。如圖5 所示，空白組少量紅色膠原纖維僅局限于匯管區(qū)位置，屬正常含量范圍；模型組各型血管壁膠原纖維自匯管區(qū)向外擴(kuò)展，已逐漸形成假小葉，破壞正常肝組織構(gòu)架與血流分布。

圖5 各組大鼠肝組織天狼猩紅染色

3.2.2 化瘀軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理改變的影響 如表2 所示，空白組大鼠全部處于病變程度0 分區(qū)域；模型組大鼠半數(shù)以上處于病變程度3 分區(qū)域，病理?yè)p傷明顯；秋水仙堿組大鼠多數(shù)處在1 分區(qū)域；化瘀軟肝膠囊組大鼠病變程度緩解情況散在分布于2、3 分區(qū)域，以高劑量組效果為佳，提示化瘀軟肝膠囊能夠不同程度改善肝纖維化模型大鼠纖維化程度。

表2 各組大鼠肝組織纖維化程度分級(jí)分布

如圖6 所示，空白組肝組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結(jié)締組織構(gòu)成，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細(xì)胞和肝血竇；與空白組比較，模型組大鼠肝組織中央靜脈周圍大量肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見微小的圓形空泡，靜脈周圍結(jié)締組織增生，不同靜脈間互相連接，形成纖維橋接，并可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟膠原纖維增生不同程度減輕，伴見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以化瘀軟肝高劑量組改善明顯。

圖6 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

3.2.3 化瘀軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖7 所示，與空白組比較，模型組p-Akt／Akt、p-mTOR／mTOR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀軟肝膠囊低劑量組p-Akt／Akt、p-mTOR／mTOR 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），秋水仙堿組和化瘀軟肝膠囊中、高劑量組p-Akt／Akt、pmTOR／mTOR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖7 各組大鼠肝組織p-Akt／Akt、p-mTOR／mTOR 蛋白表達(dá)（±s，n＝6）

3.2.4 化瘀軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)的影響 如圖8 所示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)升高；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織α-SMA 表達(dá)有不同程度降低，表明化瘀軟肝膠囊干預(yù)肝纖維化大鼠的作用機(jī)制與阻礙HSC 活化有關(guān)。

圖8 各組大鼠肝組織α-SMA （紅色） 蛋白表達(dá)（×400）

3.2.5 化瘀軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織肝組織Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)的影響 如圖9、表3 所示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3B 表達(dá)升高（P＜0.01），提示模型組大鼠體內(nèi)存在高通量自噬；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），尤其以高劑量組改善最明顯。

圖9 各組大鼠肝組織Beclin-1、LC3B 蛋白條帶圖

表3 各組大鼠肝組織Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠肝組織Beclin-1、LC3B 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別LC3-B／GAPDHBeclin-1／GAPDH空白組1.00±0.001.00±0.00模型組1.97±0.07＃＃2.66±0.02＃＃秋水仙堿組1.20±0.11**1.31±0.04**化瘀軟肝膠囊低劑量組1.73±0.16**2.32±0.04**化瘀軟肝膠囊中劑量組1.46±0.08**1.56±0.03**化瘀軟肝膠囊高劑量組1.12±0.17**1.09±0.03**

4 討論

中醫(yī)藥論治肝纖維化注重“整體觀念” 與“辨證論治” 相結(jié)合，基于生物信息系統(tǒng)觀的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，打破傳統(tǒng)單一作用成分-個(gè)別作用靶點(diǎn)-某個(gè)細(xì)胞因子的研究局限，豐富了中藥復(fù)方制劑“多點(diǎn)顯效、協(xié)同增效” 的科學(xué)內(nèi)涵［9］。本研究通過檢索與整合特定數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出化瘀軟肝膠囊有效成分128 個(gè)，藥物與疾病共有靶點(diǎn)367 個(gè)，蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點(diǎn)23 個(gè)。富集分析結(jié)果表明，化瘀軟肝膠囊抗肝纖維化作用主要通過調(diào)控PI3KAkt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等途徑實(shí)現(xiàn)，這與中藥復(fù)方制劑多成分、多途徑及多靶點(diǎn)的疾病干預(yù)性特點(diǎn)高度契合。

肝纖維化是肝硬化的病理改變基礎(chǔ)，肝硬化是肝纖維化形成典型假小葉的結(jié)果［10］。通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖、分化、炎癥、自噬及凋亡，來逆轉(zhuǎn)或阻斷這一進(jìn)程對(duì)于肝病的防治研究具有重要意義。細(xì)胞自噬一詞最早來源于古希臘語，即細(xì)胞發(fā)生自我吞噬以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)［11］。Mizushima［12］研究發(fā)現(xiàn)HSC 的自噬可以促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。另外HSC 細(xì)胞質(zhì)中含有大量脂滴［13］，HSC 自噬可能促進(jìn)了脂滴分解成游離脂肪酸，為其激活、分化及分泌ECM提供足夠的能量，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。以上研究提示，通過調(diào)控自噬，抑制HSC 的激活和增殖，可作為抗肝纖維化的有效策略之一。

自噬過程可分為自噬體的形成、延長(zhǎng)、自噬體與溶酶體融合以及降解4 個(gè)階段，且這一進(jìn)程受到多種自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)［14］。自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6 同系物（Beclin-1）與微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 （LC3B） 均參與自噬體的形成過程，并對(duì)自噬的啟動(dòng)及進(jìn)展發(fā)揮重要調(diào)控作用，越來越多的證據(jù)指出Beclin-1 與LC3-B 是自噬的標(biāo)志性蛋白，可以反應(yīng)自噬水平［15］。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA） 作為HSC激活的標(biāo)志性蛋白且與肝纖維化有高度的相關(guān)性［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織病理改變，纖維膠原沉積，組織纖維化程度嚴(yán)重。HSC 是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是肝纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，其激活和增殖介導(dǎo)了肝纖維化的病理發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中HSC 活化標(biāo)志物α-SMA 蛋白高表達(dá)，間接表明HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并啟動(dòng)過度激活效應(yīng)；模型組大鼠肝組織LC3-B、Beclin-1 蛋白表達(dá)升高，提示肝纖維化大鼠體內(nèi)存在高通量自噬，進(jìn)一步證明病理狀態(tài)下的自噬誘導(dǎo)HSC 活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積并造成肝纖維化。而經(jīng)各藥物干預(yù)后，這一結(jié)果得到不同程度的逆轉(zhuǎn)，可見化瘀軟肝膠囊干預(yù)肝纖維化的作用與阻礙HSC 活化、抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。安禎祥等［17］研究發(fā)現(xiàn)，扶脾柔肝方能干預(yù)纖維組織增生，改善肝功能，其抗肝纖維化機(jī)制可能與下調(diào)Beclin-1、LC3-B 蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬功能相關(guān)。

PI3K／Akt／mTOR 是調(diào)控自噬相關(guān)通路中最經(jīng)典的一條且主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用［18］。Akt 是一種絲氨酸（Ser）／蘇氨酸（Thr） 蛋白激酶，Akt 磷酸化主要受到上游蛋白激酶PI3K 的調(diào)控，而活化的Akt 進(jìn)一步激活下游靶蛋白mTOR，啟動(dòng)細(xì)胞自噬抑制效應(yīng)［19］。已有研究表明，采用炎癥誘導(dǎo)劑脂多糖（LPS） 誘導(dǎo)HSC-T6 細(xì)胞發(fā)生自噬與PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路有關(guān)，而人參皂苷Rg3 抑制HSC-T6 細(xì)胞存活的機(jī)制可能與其激活了這一信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)［20］。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG 分析結(jié)果，探索PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路是否為化瘀軟肝膠囊通過調(diào)控細(xì)胞自噬來發(fā)揮抗肝纖維化的作用途徑。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠肝組織p-Akt／Akt、p-mTOR／mTOR 蛋白表達(dá)降低，可見這一信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)處于功能抑制狀態(tài)；而各藥物干預(yù)后，該信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白磷酸化水平不同程度升高，進(jìn)一步激活下游靶蛋白發(fā)揮生物效應(yīng)并開放信號(hào)反饋通路，提示化瘀軟肝膠囊發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬的作用可能與激活這一自噬負(fù)調(diào)節(jié)器有關(guān)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)化瘀軟肝膠囊干預(yù)肝纖維化的多成分-多靶點(diǎn)-多通路的效應(yīng)機(jī)制；進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證發(fā)現(xiàn)，化瘀軟肝膠囊干預(yù)肝纖維化大鼠的作用主要與激活PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞自噬，阻礙HSC 活化有關(guān)，揭示了“疏肝化瘀法” 的微觀分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為中藥復(fù)方制劑論治肝纖維化提供新思路與新方法。