葛 鵬，羅亞嵐，徐秋實，許才明，張桂信，3，陳海龍*

（1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腹部急癥外科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合臨床重點學科實驗室，遼寧 大連 116011；3.大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，遼寧 大連 116044；4.大連市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 大連 116083）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP） 是胰腺的炎性疾病，是常見的外科急癥［1］。急性肺損傷（acute lung injury，ALI） 是重癥AP 最常見的并發(fā)癥，也是早期高死亡率的主要原因［2］。目前，亟待挖掘特異性藥物阻止AP 向ALI 的發(fā)展。涼膈散出自《太平惠民和劑局方》，已被廣泛應用于口腔、鼻咽及肺部炎癥［3-4］。也有報道稱涼膈散對AP、膿毒癥及腸缺血再灌注損傷亦有積極的治療作用［5-7］。然而，涼膈散治療AP-ALI 的分子機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學是一門新興學科，常被用于闡釋中藥干預疾病的分子機制。本研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學及體內(nèi)動物實驗探討涼膈散治療AP-ALI 的分子機制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學

1.1.1 涼膈散活性成分及靶點篩選 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫及TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索涼膈散中各中藥的化合物成分，并根據(jù)藥物動力學參數(shù)口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18 為標準篩選活性成分及靶點，利用Unitprot數(shù)據(jù)庫標準化靶點基因名，應用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡。

1.1.2 AP-ALI 靶點篩選及網(wǎng)絡構(gòu)建 以 “acute pancreatitis” “acute lung injury” 為關鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索與AP 和ALI 相關的疾病靶點，采用韋恩圖獲得涼膈散與AP-ALI 的交集靶點。利用Cytoscape 軟件進一步篩選并構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡。

1.1.3 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建及關鍵成分分析 利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。將結(jié)果導入Cytoscape 軟件后使用MCODE 插件篩選主要成分及關鍵靶點。

1.1.4 GO 功能及KEGG 通路分析 借助Metascape 數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行GO 和KEGG 分析，獲得關鍵靶點參與的生物學過程及相關通路。

1.1.5 分子對接 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載化合物結(jié)構(gòu)，使用AutodockTools 1.5.6 軟件對化合物及靶點分別進行加氫、去水、計算電荷等處理，并利用Autodock Vina 1.1.2軟件對接處理后的配體與受體，最后使用PyMOL 軟件可視化主要活性成分和關鍵靶標對接結(jié)果。

1.2 動物實驗

1.2.1 涼膈散制備 涼膈散由連翹15 g，黃芩、梔子、竹葉各10 g，甘草9 g，大黃、芒硝各12 g，薄荷10 g （后下）組成，購于大連同仁堂藥房，經(jīng)大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外三科許才明醫(yī)師鑒定為正品。每1 劑加水煎煮濃縮至192 mL，分2 次灌胃。

1.2.2 動物分組、造模和給藥 30 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，購于大連醫(yī)科大學SPF 動物實驗中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼） 2018-0003，實驗動物使用許可證號SYXK （遼） 2018-0007］，動物實驗經(jīng)大連醫(yī)科大學動物倫理委員會審查批準 （倫理號AEE19003）。大鼠隨機分成對照組、模型組、涼膈散組，每組10 只。對照組僅作開腹、翻動胰腺數(shù)次后關腹處理；模型組采用胰膽管逆行注射5% 牛磺膽酸鈉（50 mg／kg）的方法建立AP-ALI 模型［8］；涼膈散組于造模后2、12 h 灌胃給予涼膈散（劑量為10 g／kg，質(zhì)量濃度為0.46 g／mL）。

1.2.3 試劑與儀器 蘇木素-伊紅（HE） 染色試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司］；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH） 試劑盒（貨號E-EL-R0015c、EEL-R2856c、E-BC-K025-M、E-BC-K030-M，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） 試劑盒（貨號A044-1-1，南京建成生物工程研究所）；兔抗大鼠β-actin 抗體（貨號AP0060，南京巴傲得生物科技有限公司）；兔抗前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、兔抗腫瘤蛋白P53、兔抗血紅素加氧酶1 （HO-1）抗體（貨號A1253、A19585、A19062，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3） 抗體 （貨號ab2302，英國Abcam 公司）；TUNEL 試劑盒（批號G1501-50T，武漢賽維爾生物科技有限公司）。石蠟切片機（德國徠卡公司）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2.4 標本采集 造模24 h 后，各組隨機選取6 只大鼠，麻醉后開腹，經(jīng)腹主動脈取血約5 mL，部分全血制備血漿，通過血氣分析儀檢測PaO2和PaCO2值；部分全血分離血清，待測。剪取部分胰腺及肺組織，于4%多聚甲醛中固定，剩余部分肺組織于-80 ℃冰箱保存，待測。取右上完整肺葉測定肺濕／干重比。

1.2.5 血清淀粉酶活性和TNF-α、IL-6 水平檢測 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作，以標準品相應的吸光度值建立標準曲線，根據(jù)標準曲線檢測TNF-α、IL-6 水平；利用全自動生化分析儀檢測各組血清淀粉酶活性。

1.2.6 肺組織MDA、GSH 水平及MPO 活性檢測 嚴格按照試劑盒說明書檢測肺組織MDA、GSH 水平和MPO 活性。

1.2.7 胰腺、肺組織病理學觀察及病理評分 取固定的胰腺、肺組織，制備切片，HE 染色后，于光鏡下觀察各組胰腺、肺組織病理變化并對病理損傷進行評分。胰腺病理以腺泡壞死（0 分為無壞死；1 分為壞死面積＜15%；2 分為壞死面積15%～35%；3 分為壞死面積＞35%）、炎癥細胞浸潤（0 分為無炎性浸潤；1 分為輕度血管周圍浸潤；2 分為中度血管周圍和輕度彌漫性浸潤；3 分為大量彌漫性浸潤）、出血（0 分為無出血；1 為1～2 個出血灶；2 分為3～5 個出血灶；3 分為＞5 個出血灶） 和水腫（0 分為無水腫；1 分為片狀葉間隙增寬；2 分為彌漫性葉間隙增寬；3 分為彌漫性腺泡間隙增寬） 進行評分；肺組織以肺泡間隔增寬、炎性細胞浸潤和出血進行評分（0 分為正常肺；1 分為＜25%肺部受累；2 分為25%～50%肺部受累；3 分為50%～75%肺部受累），每個參數(shù)的評分為0～3 分。

1.2.8 大鼠肺組織TUNEL 染色檢測 石蠟切片按照試劑盒說明書操作，分析TUNEL 陽性表達結(jié)果。

1.2.9 肺組織PTGS2、cleaved caspase-3、HO-1、P53 蛋白表達檢測 取各組肺組織150 mg，加入RIPA 蛋白裂解液及研磨珠后于冰上研磨，離心取上清后測定蛋白濃度，以每孔75 μg 蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜后加一抗4 ℃孵育過夜，次日洗膜后，常溫孵育二抗120 min，ECL發(fā)光液顯影及曝光，分析各條帶灰度值。

1.2.10 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；不符合正態(tài)分布或方差不齊時進行變量轉(zhuǎn)換，若仍不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用Kruskal-Wallis 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 涼膈散與AP-ALI 成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 基于TCMSP及TCMID 數(shù)據(jù)庫獲取涼膈散化合物957 個（礦物藥芒硝未找到化合物信息，已刪去），其中連翹150 個、梔子98 個、大黃92 個、竹葉30 個、薄荷164 個、黃芩143 個、甘草280 個。經(jīng)過ADME 標準篩選并刪去重復值后得到活性成分155 個，預測靶點311 個。利用Cytoscape 軟件組建涼膈散的活性成分-靶點網(wǎng)絡，見圖1。利用GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫分別獲取AP 及ALI 相關靶點，將相關靶點與涼膈散預測靶點取交集后獲得257 個交集靶點，見圖2A。借助STRING 數(shù)據(jù)庫建立涼膈散治療AP-ALI 的PPI 網(wǎng)絡圖，涉及257 個節(jié)點，2 205 條邊。將PPI 數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件后，利用MCODE 插件進行模塊分析，共得到41 個關鍵靶點，基于關鍵靶點篩選出活性成分并構(gòu)建主要活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡，見圖2B。其中度值排名前十的靶點及成分見圖2C、表1。

表1 涼膈散治療AP-ALI 排名前十的靶點和活性成分

圖1 涼膈散活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

圖2 涼膈散與AP-ALI 交集靶點網(wǎng)絡

2.2 GO 功能與KEGG 通路富集分析 利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對41 個關鍵靶點進行功能富集分析。以P＜0.05 為篩選標準，獲得113 條生物過程（biological process，BP）、23條細胞組成 （cellular component，CC）、45 條分子功能（molecular function，MF），選取排名前十的功能信息進行注釋，見圖3A。其中涼膈散主要通過細胞外間隙、胞外區(qū)、細胞質(zhì)液、核質(zhì)參與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對藥物的反應、脂多糖介導的信號通路、NO 生物合成的正調(diào)控等生物學過程發(fā)揮酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子活性調(diào)節(jié)等功能。以P＜0.001 為篩選標準，排名前二十的信號通路見圖3B，主要涉及TNF、絲裂原激活蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）、低氧誘導因子1 （hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）、Toll 樣受體（Toll-like receptos，TLRs） 和癌癥等信號通路。

圖3 關鍵靶點的GO 和KEGG 富集分析

2.3 分子對接分析 利用Autodock Vina 1.1.2 軟件將排名前十的活性成分與排名前十的關鍵靶點進行分子對接，結(jié)果見圖4A （橫坐標代表化合物，縱坐標代表靶點）。通常認為結(jié)合能低于-5.0 kcal／mol （絕對值大于5.0） 表明分子之間具有良好的相互作用。由此可知，涼膈散主要活性成分與關鍵靶點皆具有良好的結(jié)合活性。其中，槲皮素與PTGS2 結(jié)合能為-9.5 kcal／mol，木犀草素與PTGS2 結(jié)合能為-9.6 kcal／mol，結(jié)果見圖4B～4C。

圖4 活性成分與靶點的分子對接

2.4 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織濕／干重比及PaO2、PaCO2值的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織濕／干重比和PaCO2值升高（P＜0.01），PaO2值降低（P＜0.01）；與模型組比較，涼膈散組大鼠肺組織濕／干重比和PaCO2值降低（P＜0.01），PaO2值升高（P＜0.01），見表2。

表2 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織濕／干重比及PaO2、PaCO2 值的影響 （±s，n＝6，1 mmHg＝0．133 kPa）

表2 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織濕／干重比及PaO2、PaCO2 值的影響 （±s，n＝6，1 mmHg＝0．133 kPa）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別（肺組織濕／干重比）／%PaO2／mmHgPaCO2／mmHg對照組3.53±0.1797.11±4.5327.08±1.33模型組6.02±0.62**61.80±7.17** 48.32±4.53**涼膈散組4.38±0.29＃＃78.81±5.04＃＃ 34.85±2.81＃＃

2.5 涼膈散對AP-ALI 大鼠胰腺及肺組織病理變化的影響 對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，無出血及壞死，肺組織無病理變化；模型組大鼠可見胰腺組織水腫，腺小葉分隔，大片腺小葉溶解性壞死或缺失，間質(zhì)彌漫性出血并伴有大量炎性細胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚及炎性細胞浸潤；涼膈散組大鼠胰腺組織損傷減輕，出血、壞死等情況緩解，肺組織病理損傷較模型組減輕，見圖5A。病理評分如圖5B 所示，與對照組比較，模型組大鼠胰腺、肺組織病理評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼膈散組大鼠胰腺、肺組織病理評分降低（P＜0.01）。

圖5 涼膈散對大鼠胰腺和肺組織病理的影響（×200，±s，n＝6）

2.6 涼膈散對AP-ALI 大鼠血清淀粉酶活性和炎癥因子水平的影響 血清淀粉酶活性是臨床診斷AP 的金標準，與對照組比較，模型組大鼠血清淀粉酶活性升高3 倍以上（P＜0.05），表明模型建立成功，且炎癥因子IL-6、TNF-α 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼膈散組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平和淀粉酶活性均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 涼膈散對AP-ALI 大鼠血清淀粉酶活性和IL-6、TNF-α 水平的影響（±s，n＝6）

表3 涼膈散對AP-ALI 大鼠血清淀粉酶活性和IL-6、TNF-α 水平的影響（±s，n＝6）

注：與對照組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別TNF-α／（pg·mL-1） IL-6／（pg·mL-1） 淀粉酶／（U·L-1）對照組99.38±21.1910.23±0.25914±89模型組217.00±71.99**61.14±13.20** 6 522±582**涼膈散組129.85±26.13＃14.62±3.72＃＃4 571±564＃＃

2.7 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織氧化應激標志物的影響 肺組織MPO 活性是中性粒細胞聚集指標，與對照組比較，模型組大鼠肺組織MDA 水平和MPO 活性升高（P＜0.01），GSH 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，涼膈散組大鼠肺組織MDA 水平和MPO 活性降低（P＜0.01），GSH水平升高（P＜0.01），見表4。

表4 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織MDA、GSH 水平和MPO 活性的影響（±s，n＝6）

表4 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織MDA、GSH 水平和MPO 活性的影響（±s，n＝6）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別MDA／（μmol·g prot-1）GSH／（μmol·g prot-1）MPO／（U·g prot-1）對照組0.86±0.024.75±0.420.56±0.12模型組1.52±0.03**0.43±0.41**2.51±0.07**涼膈散組1.06±0.02＃＃1.83±0.44＃＃1.44±0.83＃＃

2.8 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織細胞凋亡百分比增加（P＜0.05）；與模型組比較，涼膈散組大鼠肺組織細胞凋亡百分比降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織細胞凋亡的影響（±s，n＝6）

2.9 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織PTGS2、HO-1、P53 及cleaved caspase-3 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠肺組織PTGS2、HO-1、P53 及cleaved caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，涼膈散組大鼠肺組織PTGS2、cleaved caspase-3、P53 蛋白表達降低（P＜0.05），HO-1 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 涼膈散對AP-ALI 大鼠肺組織PTGS2、HO-1、P53 及cleaved caspase-3 蛋白表達的影響（±s，n＝6）

3 討論

AP 發(fā)展至ALI 時，炎癥介質(zhì)被大量釋放引起全身炎癥反應；腸道屏障損傷又可誘發(fā)菌群移位，內(nèi)毒素入血，對機體造成致命打擊［9］。中醫(yī)認為里、實、熱為AP 的主要病機，合并ALI 時應肺腸同治，以“通腑瀉熱” “清熱解毒” 為主［10-11］。涼膈散中的大黃及芒硝行通里攻下之功，有助于緩解腸道屏障損傷；甘草生津潤燥以緩二藥峻下之力；連翹及黃芩清解胸膈肺熱，緩解呼吸功能障礙。藥理學研究發(fā)現(xiàn)涼膈散可改善機體微循環(huán)障礙、調(diào)節(jié)機體紊亂的炎癥反應、拮抗腸道毒素對機體的損害［12-14］。肖婧等［15］發(fā)現(xiàn)涼膈散可降低AP 患者血清淀粉酶活性及住院時間。涼膈散還有助于改善AP 并發(fā)ALI 患者呼吸功能障礙并降低患者腹內(nèi)壓［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，涼膈散給藥后，大鼠胰腺及肺組織病理損傷減輕，血清淀粉酶活性、IL-6 和TNF-α 水平降低，肺組織水腫及呼吸功能障礙得到改善。因此，涼膈散可能是治療AP-ALI 的有效復方，但其具體機制尚待闡明。

本研究構(gòu)建了涼膈散-疾病靶點網(wǎng)絡，最終獲得活性成分155 個，藥物靶點共311 個。藥物與疾病交集靶點為257個，經(jīng)MCODE 插件篩選后獲得41 個關鍵靶點，包括排名前十的TNF、IL6、MMP9、HO-1、PTGS2、P53、STAT3、MAPK8、CASP3、FOS。PTGS2 是前列腺素合成的限速酶，在調(diào)節(jié)機體炎癥和免疫功能中發(fā)揮關鍵作用。有研究表明PTGS2 與AP 引起腸道炎癥和腸道屏障損傷密切相關［16］。一項臨床研究報道PTGS2 抑制劑可將嚴重急性胰腺炎（SAP） 的發(fā)生率降低約50%［17］。本研究發(fā)現(xiàn)涼膈散主要活性成分與PTGS2 皆有良好的結(jié)合活性，動物實驗結(jié)果顯示PTGS2 在模型大鼠肺組織中表達升高，涼膈散可下調(diào)其表達，提示涼膈散對AP 及其ALI 的保護功能可能與抑制PTGS2 合成相關。HO-1 是一種抗炎、抗氧化的防御基因，誘導HO-1 表達可減輕SAP 早期的全身炎癥反應及遠端器官損傷［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織HO-1 蛋白表達升高，而涼膈散對HO-1 表達具有促進作用，這提示涼膈散可能通過促進HO-1 信號通路抑制AP-ALI 的氧化應激損傷。p53 基因是一種腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白P53 是重要的細胞凋亡標記蛋白。Zhou 等［19］發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除可抑制小鼠AP 發(fā)展。caspase-3 是重要的凋亡蛋白酶，P53 可刺激胞質(zhì)內(nèi)無活性的caspase-3 裂解活化為cleaved caspase-3 形式，cleaved caspase-3 可直接反應細胞凋亡水平［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，P53、cleaved caspase-3 在模型組大鼠肺組織中表達升高，表明AP 誘導的肺組織凋亡可能由P53／caspase-3 信號介導，涼膈散可能通過抑制P53 和cleaved caspase-3 表達削減凋亡通路的激活，從而減輕AP-ALI 損傷。

綜上所述，涼膈散可有效改善AP-ALI 大鼠胰腺及肺損傷，其機制可能與促進HO-1 及抑制P53／caspase-3 通路有關。