王星禹，朱國琴，寧 可，江美芳，包怡敏，高 崎*，劉愛華*

（1.上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201703）

缺血性心臟病或突發(fā)性心臟病是全世界范圍內最常見的致死和致殘單一因素［1］，而急性心肌梗塞溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術、冠脈旁路血管移植術、體外循環(huán)等血運重建治療都面臨心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。心臟循環(huán)的重建伴隨著細胞損傷和死亡、再灌注性心律失常、心肌抑頓和血管無復流現(xiàn)象［2］。若能防治再灌注損傷，缺血心肌將能從再灌注療法中獲得更佳療效。ATP 敏感的鉀通道 （ATPsensitive potassium channel，KATP） 于1983 年由Noma 首先在豚鼠的心肌細胞上發(fā)現(xiàn)［3］，其特征是通道活性隨胞內ATP 濃度升高而被抑制。缺血時KATP激活可以保護心肌，在MIRI 時起重要保護作用［4］。

缺血預適應（IPC） 對MIRI 具有強大的保護作用，表現(xiàn)出雙時相效應，早期效應（數(shù)分鐘出現(xiàn)，持續(xù)2 h 左右）和延遲效應（24 h 后重新出現(xiàn)）［5］。據(jù)報道銀杏葉標準提取物EGb761 對缺血再灌注誘導大鼠心肌損傷具有延遲性保護作用，可能與增加NO 合成和開放胞膜KATP通道（sarcKATP） 有關［5］。但銀杏葉提取物是否還通過調節(jié)MIRI 時KATP發(fā)揮早期心臟保護作用，國內外未見相關報道。我國自主研發(fā)出具有獨立知識產(chǎn)權的新型銀杏制劑——銀杏酮酯（Ginkgobilobaextract 50，GBE50），銀杏總黃酮含量達44%以上，銀杏內酯達6%以上，毒性成分銀杏酸含量控制在5 μg／g 以下［6］。以銀杏酮酯為原料的杏靈顆粒，已通過臨床試驗，用于治療冠心病、心絞痛和腦動脈硬化、眩暈［7］。本研究擬從KATP調節(jié)入手，對銀杏酮酯如何激活心肌內源性保護機制而發(fā)揮早期心臟保護作用，進而防治MIRI 作探討性研究。

1 材料

1.1 動物 雄性成年Sprague-Dawley 大鼠，體質量（225±25） g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2017-0005］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物房［SYXK （滬） 2020-0009］，實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會審查批準 （倫理號PZSHUTCM190614008），實驗符合實驗動物福利及倫理相關規(guī)范。

1.2 藥物與試劑 銀杏酮酯（批號111002，上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司）。BCA 蛋白測定試劑盒、RIPA裂解液、Hoechst 33258 染色液、抗熒光淬滅封片液（貨號P0010、P0013B、C1018、P0126，上海碧云天生物技術有限公司）；0.45 μm 硝酸纖維素膜（NC 膜）、TEMED、胎牛血清 （FBS）、30% 丙烯酰胺 （貨號66485、DH338-1、CC-0011、MMR007，上海鼎國生物技術有限公司）；ECL發(fā)光試劑 （貨號34095，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；小鼠內向整流鉀通道 （inwardly-rectifying potassium channel，Kir） Kir6.2 單克隆抗體、兔磺酰脲類受體（sultfonylurea receptor，SUR） SUR2 多克隆抗體（貨號sc-390104、sc-25684，美國Santa Cruz 公司）；小鼠GAPDH 單克隆抗體（貨號60004-1，美國Proteintech 公司）；Ⅱ型膠原酶 （Type 2 Collagenase，貨號 LS004176，美國Worthington 公司）；蛋白酶、2，3-丁二酮一肟（BDM）、D-2-脫氧葡萄糖 （2-Deoxy-D-glucose）、連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）、格列本脲（Glibenclamide）（貨號P8340、31550、D8375、157953、58H0570，美國Sigma 公司）。

1.3 儀器 LGF-1B Langendorff 心臟灌流裝置（成都儀器廠）；GNP-9050 隔水恒溫箱、DK-S24 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；ML785 PowerLab／8sp 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)［埃德儀器國際貿易（上海） 有限公司］；IX 71 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；PowerPac HC 垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；Tanon-2500R 全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Centrifuge 5424R 低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；TS-8 垂直轉移脫色搖床、TS-2 水平脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Synergy 2 酶標儀 （美國BioTek 公司）；MultiClamp 700B 膜片鉗放大器、Digidata 1332 數(shù)模轉換器［美谷分子儀器（上海） 有限公司］；P-97 微電極拉制儀（美國Sutter 公司）；PB-10 PH 計（德國賽多利斯公司）。

1.4 溶液配制 Krebs-Henseleit （K-H） 改良液（mmol／L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，Glucose 11.0。

無鈣緩沖液 （mmol／L）：NaCl 120，KCl 5.4，NaH2PO41.2，NaHCO320，MgSO41.2，Glucose 5.6，BDM 10，Taurine 5，用稀鹽酸將pH 調至7.4。

停止酶解液：在無鈣緩沖液中加入10% FBS 和12.5 mmol／L CaCl2，即得。

缺血液 （mmol／L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，2-Deoxy-Dglucose 10，Na2S2O410，充分溶解后分裝，于-20 ℃保存。

KB 液（mmol／L）：K glutamate 100，KCl 25，MgSO42，KH2PO42，Taurine 20，Creatine base 5，EGTA 0.5，HEPES 5，Glucose 20，加KOH 校正pH 值至7.4，即得，分裝后于-20 ℃保存。

記錄IKATP電極內液（mmol／L）：Potassium L-aspartate（C4H5K2NO4） 120，KCl 20，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 10，K2ATP 10，用KOH 將pH 值調至7.2，即得。

記錄IKATP細胞外液（mmol／L）：NaCl 137，KCl 5.4，MgCl21，HEPES 10，Glucose 10，TEACl 20，Nifedipine 0.001，用NaOH 將pH 值調至7.4，即得。

銀杏酮酯母液配制：1.25 g 銀杏酮酯加入10 mL 丙二醇，加熱溶解，然后加超純水至500 mL 攪拌溶解，經(jīng)0.22 μm 混合纖維素脂膜過濾，于4 ℃冷藏室保存待用。

2 方法

2.1 離體心臟缺血再灌注（I／R） 模型建立 大鼠麻醉后分離心臟，利用Langendorff 灌流系統(tǒng)建立大鼠離體心臟I／R模型。隨機分為5 組，對照組（6 只） 以K-H 液持續(xù)灌流75 min；缺血再灌注模型組（7 只） 以K-H 液灌流15 min，停止灌流30 min 缺血，再灌注30 min；銀杏酮酯組（7 只）以含銀杏酮酯（25 mg／L［6］） 的K-H 液灌流15 min，停止灌流30 min 缺血，含銀杏酮酯（25 mg／L） 的K-H 液再灌注30 min；銀杏酮酯預處理組（6 只） 以含銀杏酮酯（25 mg／L） 的K-H 液灌流15 min，停止灌流30 min 缺血，然后用K-H 液再灌注30 min；格列本脲+銀杏酮酯預處理組（7只） 以含銀杏酮酯（25 mg／L） 和格列本脲（10 μmol／L［8］）的K-H 液灌流15 min，停止灌流30 min 缺血，然后用K-H液再灌注30 min。

2.2 心功能檢測 測量心率、左心室收縮峰壓均值（mLVSP）、左心室舒張壓均值（mLVDP）、左心室收縮壓最大上升速率（+dP／dtmax）、左心室舒張壓最大下降速率（-dP／dtmax） 等指標，并計算出左心室發(fā)展壓（DP，DP＝mLVSP-mLVDP）。記錄完畢后取心臟，將部分組織切塊在10%中性甲醛中固定備用；部分左心室肌組織稱重標記，裝入凍存管中置于-70 ℃冰柜中保存，供蛋白表達檢測。

2.3 HE 染色觀察心肌組織病理變化 取心尖組織，修剪后放入包埋框，自來水沖洗2 h 以上，置于全自動組織脫水機內，依次經(jīng)各級乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片展平貼在載玻片上，45 ℃烘箱烘干，然后脫蠟至水，行蘇木精-伊紅（HE） 染色，脫水封片，于光學顯微鏡下觀察并拍攝。

2.4 Hoechst 33258 染色觀察心肌細胞凋亡情況 將心臟組織切片脫蠟至水后，加入少量Hoechst 33258 染色液染色5 min，棄染色液，用生理鹽水洗滌2 次，滴加抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察。每組取4 個樣本，每個樣本選6～8 張照片，分析陽性染色細胞數(shù)。凋亡率以Hoechst 33258 染色陽性核蛋白數(shù)與細胞總數(shù)的比值表示。

2.5 Western blot 法檢測心肌組織Kir6.2 和SUR2 蛋白表達 提取心肌組織總蛋白，用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，轉至NC 膜，于5%脫脂奶粉溶液中封閉，孵育KATP通道蛋白Kir6.2 一抗（1 ∶1 000） 和SUR2 一抗（1 ∶500），TBST 洗膜后孵育二抗，加入ECL 發(fā)光試劑顯色，使用Image J 分析系統(tǒng)對條帶的灰度進行量化，并以GAPDH 為內參。

2.6 大鼠心室肌細胞急性分離 取10 只大鼠，麻醉后，迅速取出心臟，懸掛在Langendorff 灌注裝置上，使用主動脈插管逆向進行灌注。灌注溶液用95% O2和5% CO2的混合氣體飽和后，恒溫37 ℃以5 mL／min 體積流量灌流。心臟先用無鈣細胞分離緩沖液灌注10 min，換用含有25 mgⅡ型膠原酶、5 mg 蛋白酶、50 mol／L CaCl2和0.1% BSA 的低鈣細胞分離緩沖液酶解15 min。然后將心室在低鈣細胞分離緩沖液中剪成小塊以獲得心室肌細胞。分離成功的肌細胞呈棒狀，邊緣清晰，有收縮帶，表面光滑，可用于膜片鉗實驗。

2.7 全細胞膜片鉗記錄心室肌細胞KATP電流 心室肌細胞隨機分為4 組，對照組用KATP細胞外液灌流16 min；缺血再灌模型組先用KATP細胞外液灌流10 min，再用缺血液灌流3 min，最后以細胞外液灌流3 min；格列本脲組先用含格列本脲（10 μmol／L） 的KATP細胞外液灌流10 min，再用含格列本脲的缺血液灌流3 min，最后以含格列本脲的細胞外液灌流3 min；銀杏酮酯組先用含銀杏酮酯（25 mg／L）的KATP細胞外液灌流10 min，再用含銀杏酮酯的缺血液灌流3 min，最后以含銀杏酮酯的細胞外液灌流3 min。KATP電流（IKATP） 的記錄采用電壓鉗制模式、斜坡電壓剌激方案，即鉗制電壓-40 mV，以20 mV／s 的速率，從-100 mV去極化至+80 mV，剌激間隔為9 s。對0 mV 鉗制電壓下的電流密度進行數(shù)據(jù)分析，比較缺血前后電流變化，并用KATP通道阻斷劑格列本脲證實是否IKATP。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過IBM SPSS Statistics 22、OriginPro 2016、Graphpad 8.0 等軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心功能的影響 如圖1 所示，與對照組比較，模型組mLVSP、DP、+dP／dtmax降低（P＜0.01），mLVDP、-dP／dtmax升高（P＜0.01）。與模型組比較，銀杏酮酯組可改善mLVDP 的降低（P＜0.01），促使DP、+dP／dtmax升高（P＜0.05，P＜0.01） 和-dP／dtmax降低；銀杏酮酯預處理組同樣可促使mLVSP、DP、+dP／dtmax升高（P＜0.01），-dP／dtmax降低（P＜0.05）；格列本脲可消除銀杏酮酯對心功能的改善效應。

圖1 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心功能的影響（±s，n＝6～7，1 mmHg＝0．133 kPa）

3.2 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病理變化的影響 如圖2 所示，對照組心肌纖維排列整齊，心肌細胞完整無破損，細胞核均勻分布，心肌結構清晰有序；模型組和格列本脲+銀杏酮酯預處理組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌細胞間質有大片炎性細胞浸潤，多數(shù)心肌細胞破裂并出現(xiàn)核消融現(xiàn)象，心肌結構模糊不清；銀杏酮酯組部分心肌纖維排列紊亂，部分組織有炎性浸潤，少數(shù)心肌細胞破裂，少有細胞核消融，心肌結構基本清晰。

圖2 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病理變化的影響（HE，×200）

3.3 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響 Hoechst 33258 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常心肌細胞核呈彌散均勻的淡藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核呈致密濃染亮藍色熒光。如圖3 所示，對照組心肌存在少量凋亡細胞；與對照組比較，模型組可見大量凋亡細胞，細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀杏酮酯組心肌細胞凋亡率降低（P＜0.01）；與銀杏酮酯組比較，格列本脲+銀杏酮酯預處理組心肌細胞凋亡率升高 （P＜0.05）。

圖3 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響（×400，±s，n＝4）

3.4 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織KATP通道蛋白Kir6.2 和SUR2 亞基表達的影響 如圖4 所示，各組間心肌KATP通道蛋白Kir6.2 表達比較無明顯差異（P＞0.05）。與對照組比較，模型組心肌組織SUR2 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀杏酮酯組心肌組織SUR2 蛋白表達升高（P＜0.05）；與銀杏酮酯組比較，格列本脲+銀杏酮酯預處理組心肌SUR2 蛋白表達降低，恢復至對照組水平（P＜0.01）。

圖4 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷心肌組織Kir6．2 和SUR2 蛋白表達的影響（±s，n＝5～6）

3.5 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷心室肌細胞IKATP的影響 如圖5 所示，使用正常細胞外液灌流，并未記錄到具有KATP通道特征的膜電流活動，0 mV 電壓下的電流密度基本為0；模型組KATP通道開放，0 mV 電壓下的電流密度由對照組的（0.01±0.07） pA／pF 上升到（1.37±0.24） pA／pF；加入格列本脲后，該電流基本被抑制，故證實記錄到的外向電流就是IKATP［8］；而使用銀杏酮酯灌流則進一步促進KATP通道的開放，其電流密度比缺血再灌注模型組提升140% （P＜0.05）。

圖5 銀杏酮酯對缺血再灌注損傷心室肌細胞IKATP的影響（±s，n＝7～10）

4 討論

MIRI 早期左心室收縮／舒張功能變化，可通過離體大鼠心臟Langendorff 灌流模型血流動力學和心肌力學指標體現(xiàn)［9］。I／R 模型組的大鼠心臟在再灌后血流動力學指標mLVSP、DP 與平衡灌流時相比降低，mLVDP 與平衡灌流時相比抬高；心肌力學指標+dP／dtmax、-dP／dtmax與平衡灌流時相比降低，表明I／R 損傷可抑制心肌收縮和舒張的功能。銀杏酮酯組全程灌流改善mLVDP，DP 和-dP／dtmax，而缺血前銀杏酮酯灌流（即預處理） 可改善mLVSP，DP和±dP／dtmax，說明前者僅對舒張功能有益，而后者有助于改善收縮和舒張功能，這可能與銀杏酮酯的負性肌力有關［10］。而格列本脲+銀杏酮酯預處理組可取消后者改善舒張功能的作用，對收縮功能（mLVSP） 無影響，因此后續(xù)的實驗不設置銀杏酮酯預處理組。而非特異性KATP阻斷劑格列本脲能消除銀杏酮酯對舒張功能的保護作用，提示銀杏酮酯對I／R 損傷過程中心臟的保護作用在缺血時發(fā)生，且與KATP通道開放有關。

心肌組織病理結果是最直接反映缺血再灌注對心肌組織損傷的證據(jù)，銀杏酮酯可以改善缺血再灌注造成的心肌細胞破裂、心肌纖維紊亂及炎性細胞浸潤。心肌缺血再灌可以誘導心肌細胞的凋亡，而銀杏酮酯已被發(fā)現(xiàn)可減少冠狀動脈左前降支結扎導致的大鼠I／R 心肌細胞凋亡（TUNEL 染色）［11］。本研究進一步通過Hoechst 33258 染色檢驗凋亡信號，證實銀杏酮酯可減輕離體心臟I／R 心肌細胞凋亡。格列本脲可逆轉銀杏酮酯對缺血再灌注心肌組織和細胞凋亡的改善作用，說明銀杏酮酯抑制I／R 心肌損傷可能通過激活ATP 敏感的鉀通道產(chǎn)生保護心肌的效應。

研究已經(jīng)證明在缺氧或缺血條件下KATP通道的藥理學活化可以導致心肌保護作用［12-13］。在哺乳動物心肌中，KATP通道分別在細胞膜（sarcKATP） 和線粒體（mitoKATP）中表達。mitoKATP通道的激活被認為通過調節(jié)線粒體體積，鈣處理和線粒體的膜電位來改善線粒體功能［14］。有更多的證據(jù)表明，sarcKATP通道的激活也具有心臟保護性。如sarcKATP通道缺陷（KO） 小鼠心臟不能表現(xiàn)出預處理對I／R損傷的保護作用；在野生型小鼠心臟中，這種“受損” 的狀態(tài)可通過選擇性sarcKATP通道抑制劑HMR1098 所模擬［15］。sarcKATP通道的激活可以減少缺氧誘導大鼠心室肌細胞的鈣超載［16］，并且在保護心室肌細胞免受缺氧／復氧損傷中起重要作用［17］。此外，Suzuki 等［18］研究表明，二氮嗪（長期以來被認為是選擇性mitoKATP開放劑） 的心臟保護作用事實上主要由sarcKATP通道的激活所介導。因此本研究進一步聚焦研究sarcKATP激活是否參與銀杏酮酯的心肌保護作用。

分子生物學研究表明，KATP通道是內向整流鉀通道（Kir） 和ATP 結合蛋白超家族成員磺酰脲類受體（SUR）兩種亞基構成的復合體。Kir6 亞基（Kir6.1 和Kir6.2） 形成通道的孔相結構，而 SUR 亞基 （SUR1、SUR2A、SUR2B） 負責調節(jié)通道的功能活性［19］和ATP 對通道的敏感性。在小鼠心臟中SUR2A 和Kir6.2 是構成心室肌細胞KATP通道的主要成分［20］。在Kir6.2-／-基因敲除小鼠心臟缺血再灌注后嚴重攣縮開始時間變短［21］。Kir6.2-／-小鼠心肌細胞接受異丙腎上腺素刺激后，舒張期鈣超載，心肌損傷，死亡率增加［22］。而Jovanovi＇c 等［23-24］發(fā)現(xiàn)SUR2A 表達的適度增加可保護心臟免受缺血／再灌注和缺氧的代謝應激，且SUR2A 表達的增加足以增加胞膜KATP通道的數(shù)目。過表達SUR2A 的小鼠胞膜KATP通道的數(shù)量相應增加，對MIRI 抵抗力也隨之增加［25］。由此可見，KATP激活是心肌缺血時重要的適應性保護機制，其作用有賴于Kir6.2 亞基的存在和SUR2A 的表達增加。本研究發(fā)現(xiàn)I／R 過程中大鼠心肌Kir6.2 亞基表達并未見變化，這與有研究報道心肌梗死后心肌細胞中Kir6.2 蛋白表達未改變一致［26］。而I／R 使SUR2 表達增高，銀杏酮酯則進一步促進SUR2 的表達，提示銀杏酮酯可通過促進I／R 心肌SUR2 表達增加胞膜KATP通道的數(shù)目。

為了直觀觀察心肌細胞膜KATP通道的情況，本課題組使用全細胞膜片鉗記錄IKATP。結果發(fā)現(xiàn)模型組KATP通道開放，0 mV 電壓下的電流密度增大，說明原本關閉的心臟胞膜KATP通道在代謝應激的狀態(tài)下開放［5，27］；而使用銀杏酮酯灌流則進一步促進KATP通道的開放，由此可以推測銀杏酮酯對I／R 心肌損傷的保護作用可能與激活KATP通道有關。缺血時胞膜KATP激活開放后，心肌細胞復極化時K+外流增加，導致動作電位時程縮短，Ca2+內流減少，從而減輕細胞內鈣超載［28］；同時心肌收縮力減弱，減少ATP 消耗，降低能量消耗［29］，減輕心肌損傷，改善心臟功能。有研究表明，由sarcKATP通道活化引起的靜息膜電位的超極化足以導致心室肌細胞中更有效的Ca2+擴散，導致復氧誘導的鈣超載水平的降低［17］。之前的研究發(fā)現(xiàn)銀杏酮酯抑制缺血心室肌細胞鈣超載［30］，可降低右心房自律性，降低心房收縮力［10］，具有負性肌力作用。因此，銀杏酮酯缺血預處理對心臟的保護可能通過激活sarcKATP通道，減輕細胞鈣超載，維持心肌細胞的鈣穩(wěn)態(tài)，同時負性肌力作用限制能量消耗而產(chǎn)生。格列本脲能消除銀杏酮酯的保護作用，需要進一步實驗證實銀杏酮酯缺血預處理的保護作用是否還通過mitoKATP發(fā)生。

綜上所述，銀杏酮酯通過增加KATP通道SUR2 亞基的表達，使I／R 期間KATP通道數(shù)量增加，激活并促進sarcKATP通道的開放，減輕鈣超載，抑制心肌細胞凋亡和心肌損傷。本研究對臨床運用銀杏酮酯防治MIRI 有一定的指導意義，今后仍需對銀杏酮酯激活KATP通道防治MIRI 的具體機制做進一步的研究。