王燕萍，陳軍輝，白瑞斌，宋平平，曹陽洋，胡芳弟*

（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI） 主要表現(xiàn)為腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR） 迅速下降以及含氮廢物的滯留，通常與膿毒癥、心血管衰竭、充血性心力衰竭、大型手術(shù)、腎臟毒素或尿路梗阻有關(guān)。慶大霉素是治療革蘭氏陰性菌引起感染的一種氨基糖苷類抗生素，臨床上10%～30% 接受過慶大霉素治療的患者會產(chǎn)生AKI［1］。慶大霉素誘導(dǎo)腎損傷的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，但是慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷能產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化水平增加，抗氧化酶活性降低等［2］，AKI患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，導(dǎo)致腎功能障礙的發(fā)生［3-4］；同時，慶大霉素可嚴(yán)重?fù)p傷腎組織結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大面積組織壞死，腎小管空泡化，腎小球皺縮，細(xì)胞排列疏松，刷狀緣不規(guī)則等現(xiàn)象［5］。

淫羊藿來源于小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai 的干燥葉［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明淫羊藿具有增強(qiáng)免疫［7］、抑制腫瘤［8-9］、抗炎［10］、抗骨質(zhì)疏松［11-13］、抗氧化［14］等多種藥理活性。楊舸［15］研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可以通過改善氧化應(yīng)激，減少炎癥反應(yīng)，通過抗凋亡途徑來減少順鉑引起的小鼠腎損傷。目前尚未見到與淫羊藿臨床及實際應(yīng)用相關(guān)的提取物對慶大霉素引起的AKI 保護(hù)作用的報道。淫羊藿作為補(bǔ)益類中藥，在臨床和日常生活中以中藥湯劑和藥酒2 種形式使用，因此本實驗研究淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物對慶大霉素誘導(dǎo)AKI 大鼠的保護(hù)作用，并探究淫羊藿發(fā)揮腎保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 80 只SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（220±20） g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （甘） 2019-0002］，飼養(yǎng)于12 h／12 h 晝夜循環(huán)、（25±2） ℃環(huán)境，提供充足的飼料和水。上述所有程序均按照世界醫(yī)學(xué)會的道德規(guī)范執(zhí)行，實驗方案通過了蘭州大學(xué)藥學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥物 慶大霉素、4%組織細(xì)胞固定液（貨號G8170、P1110，北京索萊寶科技有限公司）；NO、BUN、UA、Cr、T-SOD、CAT、MDA 檢測試劑盒（貨號A013-2-1、C013-2-1、C012-2-1、C011-2-1、A001-1-2、A007-2-1、A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；IL-10 檢測試劑盒（批號3947，江蘇酶免實業(yè)有限公司）。淫羊藿野生品于2019 年5 月初采自甘肅省禮縣中壩鄉(xiāng)，自然陰干，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任藥師鑒定為淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.的干燥葉。

1.3 儀器 腎臟腎小球濾過率監(jiān)測裝置（NIC-Kidney，型號UD0877，德國曼海姆公司）；酶標(biāo)儀（型號infiniteF50，上海博源生科技有限公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物的制備及黃酮含量測定 取淫羊藿粉末（過3 號篩） 300 g，加入30 倍量水，煎煮提取1 h，同法重復(fù)3 次，過濾后合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得淫羊藿水提取物，得率為19.85%。另取淫羊藿粉末（過3 號篩） 300 g，加入30 倍量70% 乙醇，回流提取1 h，同法重復(fù)3 次，過濾后合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得淫羊藿70% 乙醇提取物，得率為21.45%。淫羊藿中主要有效成分為黃酮類［16］，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷I （以下簡稱5 種黃酮） 的含量較高且具有廣泛的活性［17］，本實驗分別采用紫外分光光度法和HPLC-DAD 法對淫羊藿水提物和淫羊藿70%乙醇提取物中的總黃酮和5 種主要黃酮含量進(jìn)行測定。

2.2 動物分組、造模和給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組和淫羊藿水提取物、70% 乙醇提取物低、中、高劑量組（100、170、300 mg／kg，約為臨床等效劑量的1／1.732、1、1.732 倍），淫羊藿各提取物各劑量組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予生理鹽水，連續(xù)給藥15 d。第6 天開始，除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射慶大霉素（100 mg／kg），連續(xù)10 d，以誘導(dǎo)建立大鼠AKI 模型。

2.3 取材 最后一次給藥，大鼠腹主動脈采血，離心分離血清，保存?zhèn)溆?。取腎組織，除去脂肪和結(jié)締組織，在生理鹽水中漂洗，取一部分置于4%組織細(xì)胞固定液中，固定24 h 后包埋在石蠟中，用于組織學(xué)研究；另一部分保存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot 檢測。

2.4 腎小球濾過率測定 給藥結(jié)束24 h 后，將大鼠麻醉，剃除耳朵下方上背部的所有毛發(fā)以減少對FITC-sinistrin 測量的干擾。光學(xué)設(shè)備采集基線熒光2 min 后通過尾靜脈注射FITC-sinistrin （溶于0.9% 生理鹽水，劑量5 mg／100 g，注射量為0.2 mL／100 g），通過微型光學(xué)設(shè)備NIC-Kidney，對FITC-sinistrin 進(jìn)行實時監(jiān)測，測量連續(xù)熒光2 h，并使用MPD Lab Ver 1.0RC3 軟件分析清除曲線。使用一室模型，計算FITC-sinistrin 的清除半衰期（t1／2），并采用由制造商開發(fā)和驗證的半經(jīng)驗方程將t1／2值轉(zhuǎn)換為GFR 值［mL／（min·100 g-1）］，公式為GFR＝31.26／t1／2［18］。

2.5 血清腎功能、氧化應(yīng)激及炎癥因子水平檢測 按照相應(yīng)試劑盒說明書檢測血清BUN、UA、Cr、MDA、IL-10、NO 水平和T-SOD、CAT 活性。

2.6 組織病理學(xué)分析 將腎組織固定在4%組織細(xì)胞固定液中24 h 以上，然后用75%乙醇脫水并包埋在石蠟中，切成4 μm 厚的切片，HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 法檢測腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá) 用預(yù)冷的PBS 沖洗腎組織，取部分腎組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液于冰上放置30 min，勻漿后于4 ℃下12 000 r／min 離心5 min，收集上清液，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸5 min進(jìn)行變性。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗二抗后顯色發(fā)光，分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮的平均含量分別為35.24%和50.01%。與淫羊藿水提取物比較，淫羊藿70%乙醇提取物中各主要黃酮含量和總黃酮含量均較高，其中朝藿定A、朝藿定C，淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ以及總黃酮的含量差異具有顯著性（P＜0.01），見表1。

表1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量比較（%，±s，n＝3）

表1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量比較（%，±s，n＝3）

注：與淫羊藿水提取物比較，**P＜0.01。

提取物朝藿定A朝藿定B朝藿定C淫羊藿苷寶藿苷I總黃酮淫羊藿水提取物1.93±0.303.06±0.667.05±0.2513.05±0.010.48±0.2335.24±4.67淫羊藿70%乙醇提取物2.65±0.63** 3.38±0.0510.35±0.08**20.84±0.89**1.29±0.24**50.01±0.34**

3.2 淫羊藿對腎損傷大鼠腎功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠GFR 值降低（P＜0.01），血清UA、BUN 和Cr水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，淫羊藿水提取物各劑量組血清UA、BUN 和Cr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿水提取物高劑量組GFR 值升高（P＜0.01）；淫羊藿70%乙醇提取物各劑量組GFR 值升高（P＜0.05，P＜0.01），Cr 水平降低（P＜0.01），UA 和BUN 水平無明顯變化（P＞0.05），見圖1。

圖1 淫羊藿對腎損傷大鼠腎功能的影響（±s，n＝10）

3.3 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織病理學(xué)的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織病理損傷明顯，近曲小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同階段的變性，除了上皮細(xì)胞空泡化和偶爾的脫屑外，還觀察到腎小管壞死，間質(zhì)顯示水腫，輕度炎癥細(xì)胞浸潤和外滲紅細(xì)胞增加；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物組大鼠腎組織上述損傷得到改善，表現(xiàn)為腎小管壞死、上皮細(xì)胞空泡化和外滲紅細(xì)胞減少，見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織病理HE 染色（×200）

3.4 淫羊藿對腎損傷大鼠血清MDA 水平和SOD、CAT 活性的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清MDA 水平升高（P＜0.01），T-SOD、CAT 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物各劑量組SOD、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿水提取物各劑量組和70%乙醇提取物低劑量組MDA 水平降低（P＜0.01）。

圖3 淫羊藿對腎損傷大鼠血清MDA 水平和SOD、CAT 活性的影響（±s，n＝10）

3.5 淫羊藿對腎損傷大鼠血清NO、IL-10 水平的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清NO 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70% 乙醇提取物各劑量組NO 水平降低（P＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 淫羊藿對腎損傷大鼠血清NO、IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

3.6 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，慶大霉素處理可以升高大鼠的Bax 蛋白表達(dá)（P＜0.01），降低Bcl-2 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。與模型組比較，損傷大鼠給予淫羊藿水提物和70%乙醇提取物可以降低Bax 蛋白表達(dá)（P＜0.01），升高Bcl-2 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝10）

4 討論

慶大霉素是氨基糖苷類抗菌藥物，因其對革蘭陰性菌和腸球菌等感染具有顯著的療效而被廣泛應(yīng)用于臨床，但其容易引發(fā)腎臟功能的損傷。慶大霉素的腎毒性機(jī)制主要有①慶大霉素在近端腎小管上皮細(xì)胞積聚后導(dǎo)致上皮細(xì)胞缺血或壞死等［19］；②慶大霉素可降低GFR，升高血清中Cr和BUN 水平［5］。有研究表明，血清中UA 的增加也會導(dǎo)致腎功能的減退［20］。因此，GFR 水平，血清Cr、BUN 和UA水平均可作為評價腎功能的指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，大鼠給予慶大霉素造模后，GFR 降低，而血清Cr、BUN 和UA水平升高，采用淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物治療后，可逆轉(zhuǎn)上述影響，說明淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物均具有腎保護(hù)的作用。

急性腎損傷的發(fā)病與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和線粒體功能等密切相關(guān)，氧化應(yīng)激相關(guān)的特征性指標(biāo)主要包括MDA、T-SOD、CAT 等［21-22］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其水平可以反映脂質(zhì)過氧化的程度。T-SOD 是生物體內(nèi)的一種重要抗氧化酶，它可以保護(hù)生物體免受超氧陰離子自由基的損害，維持氧自由基的平衡，從而維護(hù)細(xì)胞和組織的正常功能。CAT 的主要作用是催化過氧化氫（H2O2） 分解為水和氧氣，清除體內(nèi)的H2O2，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是氧化應(yīng)激過程中的關(guān)鍵酶之一。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清MDA 水平升高，T-SOD和CAT 活性降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，MDA 水平降低，T-SOD 和CAT 活性升高。上述研究結(jié)果顯示，淫羊藿提取物可通過抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

研究表明適量的NO 可以擴(kuò)張腎小球系膜，改善腎小管和腎小球的不良情況。然而，過量的NO 可能會降低腎組織的抗氧化作用，導(dǎo)致腎損傷。降低NO 水平后，腎損傷得到明顯改善，功能作用得到提升［23］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清NO 水平升高；而給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物干預(yù)后，血清NO 水平降低。IL-10 也是反映炎癥及氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，具有腎保護(hù)作用［24］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清IL-10 水平降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，血清IL-10 水平增加。上述研究結(jié)果顯示，淫羊藿提取物可抑制慶大霉素導(dǎo)致急性腎損傷大鼠體內(nèi)的炎癥水平，從而發(fā)揮腎保護(hù)的作用。

Bcl-2 和Bax 蛋白分別是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的蛋白，是一對重要的正負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白，編碼的Bax 蛋白可與Bcl-2 之間形成二聚體，從而對Bcl-2 蛋白產(chǎn)生抑制。因此，Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)是評價細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)［25-26］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，Bax 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，說明淫羊藿提取物可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護(hù)腎組織的作用。

綜上所述，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物對慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)理可能與抑制氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡有關(guān)。