李俊江，徐志偉，畢映燕，李季文，楊小源

（甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

慢性膽囊炎是臨床常見慢性膽道系統(tǒng)疾病之一，主要癥狀包括惡心、腹脹、嘔吐、噯氣、厭食油膩、右上腹反復(fù)疼痛等［1］，西醫(yī)治療重在緩解炎癥、促進(jìn)排石，效果明顯但難以根治，同時(shí)伴有較多副作用［2-3］。中醫(yī)認(rèn)為，慢性膽囊炎屬“膽脹” “脅痛” 范疇［4］，若膽氣不降、臟腑郁滯不通則易誘發(fā)膽腑脹滿、疼痛等諸多不適癥狀［5］，治療時(shí)側(cè)重疏肝理氣、通腑利膽。

舒肝利膽方為甘肅省中醫(yī)院協(xié)定方，由醋柴胡、金錢草、白豆蔻、荊芥等13 味中藥組成，具有疏肝理氣、清熱祛濕、利膽止痛功效，臨床上治療慢性膽囊炎多年。為了促進(jìn)舒肝利膽方臨床使用范圍，更好地服務(wù)于患者，本實(shí)驗(yàn)擬將該方制成臨床療效顯著、丸劑載藥量多、穩(wěn)定性好、服用方便的濃縮丸。

CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法綜合了層次分析法（AHP）、基于指標(biāo)相關(guān)性的權(quán)重確定方法（CRITIC） 的優(yōu)越性，既可保持權(quán)重稀釋的穩(wěn)定性，又能較好地區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)信息［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝利膽濃縮丸提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 A-10 型高效液相色譜儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；LX2200C 型（0.01 g）、LX120A 型（0.000 1 g） 電子分析天平（瑞士普利賽斯公司）；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；HXGZ-000800 型電熱恒溫干燥箱、KQZ3200E 型超聲波清洗機(jī)（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）。

1.2 試劑與藥物 柴胡、金錢草、豆蔻、紫蘇子、白芥子、甘草、大棗、干姜等藥材均購(gòu)自甘肅康樂藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院楊小源主任中藥師鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定。甘草苷 （批號(hào)111610-201607）、迷迭香酸（批號(hào)111871-201706）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818）、槲皮素（批號(hào)100081-201610）、柴胡皂苷a （批號(hào)20736-09-8） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（純度≥98%）。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.1.1 供試品溶液制備 精密量取提取液10 mL，蒸干，甲醇定容至25 mL 量瓶中，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇定容至10 mL 量瓶中，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為甘草苷2.16 mg／mL、迷迭香酸4.12 mg／mL、橙皮苷2.05 mg／mL、槲皮素0.08 mg／mL、柴胡皂苷a 2.12 mg／mL）。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，制成缺甘草、紫蘇子、枳殼、金錢草、柴胡的陰性樣品，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.4 色譜條件 Waters Symmetry Shield RP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），DAD 檢測(cè)器；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸 （B），梯度洗脫 （0～12 min，17% A；12～18 min，17%～22%A；18～24 min，22%～30%A；24～32 min，30%～38% A；32～45 min，38%～80% A；45～55 min，80%～17%A）；體積流量1 mL／min；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)0～18 min 237 nm，18～24 min 283 nm，24～28 min 330 nm，28～35 min 368 nm，35～55 min 210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.5 系統(tǒng)適用性考察 精密量取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度良好，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定10 μL。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程分別為甘草苷Y＝0.401 2X-0.287 7，線性范圍0.216 1～2.160 3 mg／g；迷迭香酸Y＝1.913 6X-1.370 4，線性范圍1.036 6～10.311 6 mg／g；橙皮苷Y＝0.380 8X-0.270 1，線性范圍0.205 4～2.053 2 mg／g；槲皮素Y＝0.001 5X-0.000 8，線性范圍0.000 8～0.008 1 mg／g；柴胡皂苷aY＝1.182X-0.853 4，線性范圍0.636 6～6.363 1 mg／g。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密量取同一份供試品溶液10 μL，同一天內(nèi)在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；隔天取置于冰箱中冷藏的同一份供試品溶液適量，連續(xù)2 d 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每天3次，計(jì)算日間精密度，測(cè)得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 日內(nèi)精密度RSD 分別為1.03%、1.01%、1.02%、1.05%、1.03%，日間精密度RSD 分別為1.11%、1.13%、1.16%、1.07%、1.09%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份本品，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量RSD 分別為1.33%、0.51%、1.37%、0.69%、1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.38%、1.04%、0.22%、1.41%、0.71%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的供試品溶液9 份，隨機(jī)分為3 組，分別精密加入80%、100%、120%水平對(duì)照品溶液，在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 平均加樣回收率分別為101.14%、98.92%、101.15%、99.51%、99.98%，RSD 分別為0.12%、0.76%、1.10%、1.02%、0.54%。

2.2 干浸膏得率測(cè)定 精密量取按最優(yōu)工藝提取的供試品溶液10 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算得率。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 浸泡時(shí)間 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水分別浸泡0～240 min 后提取90 min，濃縮至70 mL，測(cè)定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇30、60 min 作為后續(xù)優(yōu)化研究中的最低、最高水平值。

2.3.2 提取時(shí)間 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水，以30 min 為節(jié)點(diǎn)分別提取0～180 min，濃縮至70 mL，測(cè)定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇60、120 min 作為后續(xù)優(yōu)化研究中的最低、最高水平值。

2.3.3 提取次數(shù) 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水分別提取1、2、3 次，每次90 min，將提取2 次以上者濃縮至70 mL，測(cè)定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。結(jié)果，提取3 次時(shí)各成分含量最高，并與提取1、2 次時(shí)相比有明顯差異，故最終選擇3 次，并不再進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.4 加液量 按處方比例平行稱取藥材6 份，分別加入6～16 倍量水提取60 min，濃縮至70 mL，測(cè)定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇8、12 倍作為后續(xù)優(yōu)化研究中的最低、最高水平值。

2.4 指標(biāo)權(quán)重確定 參考文獻(xiàn)［7-9］ 報(bào)道。

2.4.1 CRITIC 法 該方法以標(biāo)準(zhǔn)差σj體現(xiàn)對(duì)比強(qiáng)度，指標(biāo)間相關(guān)性Rj體現(xiàn)沖突性，公式為其中rij表示評(píng)價(jià)指標(biāo)i、j之間的相關(guān)系數(shù)；Cj表示第j個(gè)指標(biāo)的信息量，公式為Cj＝＝σjRf（j＝1，2，3，4，5，6，7，…），其數(shù)值越大，第j個(gè)指標(biāo)信息量、相對(duì)重要性也越大，客觀權(quán)重Wj公式為Wj＝

以公式指標(biāo)成分值＝［（實(shí)測(cè)值-最小值）／（最大值-最小值）］ ×100 計(jì)算對(duì)比強(qiáng)度（σj）、沖突性（Rj）、綜合權(quán)重（Cj）、客觀權(quán)重（Wj），得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率客觀權(quán)重分別為0.142 5、0.209 4、0.142 7、0.123 2、0.193 6、0.188 6。

2.4.2 AHP 法 綜合考慮藥味配伍規(guī)律、含量、藥理作用等方面，以量化的柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率為權(quán)重指標(biāo)，分成6 個(gè)層次，依次為柴胡皂苷a 含量、槲皮素含量、迷迭香酸含量、橙皮苷含量、甘草苷含量、干浸膏得率，構(gòu)建成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣，見表1。

表1 各指標(biāo)成對(duì)比較的優(yōu)先判斷矩陣

最終，經(jīng)層次分析后柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率權(quán)重系數(shù)分別為0.380 6、0.251 6、0.160 2、0.100 9、0.064 3、0.042 5，一致性比列因子（CR）＝0.02＜0.10，即各指標(biāo)優(yōu)先判斷矩陣的一致性均符合要求。

2.4.3 CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法 在“2.4.1” “2.4.2” 項(xiàng)下結(jié)果基礎(chǔ)上計(jì)算復(fù)合權(quán)重ω復(fù)合ij，公式為ω復(fù)合ij＝ωAHPij ωCRITICij／∑ωAHPijωCRITICij，得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率復(fù)合權(quán)重分別為0.333 4、0.323 9、0.140 5、0.076 4、0.076 5、0.049 3。

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、加液量（C） 為影響因素，柴胡皂苷a （Y1）、槲皮素（Y2）、迷迭香酸（Y3）、橙皮苷（Y4）、甘草苷（Y5） 含量及干浸膏得率（YG） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按“2.4.4” 項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分 （Y），結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得方程為Y＝81.62+20.15A-0.12B-15.69C+6.43AB+8.53AC+19.71BC-21.29A2+2.23B2-16.82C2，相關(guān)系數(shù)為0.996 9，校正系數(shù)為0.990 8，表明模型擬合度好，試驗(yàn)誤差小，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為浸泡時(shí)間（A） ＞加液量（C） ＞提取時(shí)間（B），響應(yīng)面分析見圖2。最終確定，最優(yōu)工藝為藥材浸泡45 min 后加10倍量水提取3 次，每次90 min。

表3 方差分析

圖2 各因素響應(yīng)面圖

2.6 綜合評(píng)分比較 分別采用CRITIC 法、AHP 法、CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法計(jì)算權(quán)重系數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見表4。再計(jì)算相關(guān)系數(shù)，得CRITIC 法、AHP 法該數(shù)值為0.952，CRITIC 法、CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法該數(shù)值為0.946，AHP 法、CRITIC-AHP 復(fù)合加權(quán)法該數(shù)值為0.999，表明3 種方法有顯著相關(guān)性（P＜0.05），評(píng)分具有一致性；CRITIC 法、AHP 法該數(shù)值為0.178，無顯著相關(guān)性（P＞0.05），表明所反映的信息不具有疊加性。

表4 各方法所得綜合評(píng)分（分）

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例平行稱取藥材6 份，按“2.5”項(xiàng)優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得綜合評(píng)分分別為98.91、99.02、98.88 分，平均值為98.94 分，RSD 為0.074 5%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇 舒肝利膽濃縮丸中主要成分均為對(duì)應(yīng)藥味的2020 年版《中國(guó)藥典》 檢測(cè)指標(biāo)或重要活性物質(zhì)，其中柴胡皂苷a 具有抗腫瘤、抗肝毒、抗病毒、抗高血脂、抗內(nèi)毒素、抗過敏、抗細(xì)胞黏附等作用［10］；槲皮素具有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性等作用［11］；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性［12］；橙皮苷可降低毛細(xì)血管脆性，增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性［13］；甘草苷具有抗氧化、抗衰老、抗纖維化、抗哮喘、抗肝損傷、抗肝癌作用［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 權(quán)重系數(shù)計(jì)算方法選擇 CRITIC 法是利用評(píng)價(jià)指標(biāo)本身標(biāo)準(zhǔn)偏差和相關(guān)系數(shù)來綜合衡量相關(guān)權(quán)重的客觀賦權(quán)方法，雖然所得權(quán)重系數(shù)受人為因素影響較少，但指標(biāo)之間的輕重關(guān)系易忽視。AHP 是基于層次分析結(jié)合數(shù)學(xué)邏輯思維來分析多個(gè)目標(biāo)信息，計(jì)算相對(duì)于上一層信息的本層信息權(quán)重比例的主觀賦權(quán)方法，但其所得權(quán)重系數(shù)主觀性較強(qiáng)，而且易忽視評(píng)價(jià)指標(biāo)本身的客觀數(shù)據(jù)信息。CRITICAHP 復(fù)合加權(quán)法結(jié)合上述2 種方法優(yōu)勢(shì)，既可保持權(quán)重系數(shù)的穩(wěn)定性，又能較好地區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)信息，本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化舒肝利膽濃縮丸提取工藝，其簡(jiǎn)便可行，質(zhì)量穩(wěn)定，可為該制劑后期制備提供參考［15-16］。