趙貝貝，崔曉峰，金遠(yuǎn)林，黃汝成，劉曉銘

（深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518133）

芍藥甘草湯由芍藥和甘草組成，源自張仲景《傷寒論》，“若厥愈足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸”。白芍苦酸，甘草甘平，酸甘合化，能養(yǎng)血斂陰，和中緩急，陰液得復(fù)，筋脈得養(yǎng)，共奏益陰柔筋緩急之功?，F(xiàn)代研究表明，芍藥甘草湯在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中應(yīng)用廣泛，如三叉神經(jīng)痛［1］、癲癇［2］、脊髓損傷［3］、周圍神經(jīng)損傷［4］、帕金森?。?］等。帕金森病為神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)障礙疾病，主要癥狀是震顫、僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)不穩(wěn)、體位不穩(wěn)等，具有逐漸加重的特征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［6］。目前認(rèn)為腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和丟失是帕金森病的主要病理學(xué)特征［7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯可有效保護(hù)大鼠帕金森病模型腦黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元，緩解肌強(qiáng)直，提高帕金森病大鼠自主活動(dòng)度［8］，但其作用機(jī)制尚不清楚。新的研究表明，多巴胺能神經(jīng)元自噬能力的降低是造成神經(jīng)元變性和丟失的重要原因，調(diào)節(jié)自噬是防治帕金森病的重要途徑之一［7，9］?；诖耍狙芯繉⑻接懮炙幐什轀珜?duì)帕金森病大鼠模型腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自噬水平的調(diào)控及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 38 只SPF 級(jí)Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0010］，飼養(yǎng)于瑞業(yè)模型動(dòng)物（廣州） 生物科技有限公司SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （粵） 2020-0218］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)瑞業(yè)模型動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)20220312）。

1.2 藥物與試劑 甘草片（批號(hào)210500521） 和白芍（批號(hào)211000209） 購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院主管中藥師梁華鈞鑒定為豆科植物甘草的干燥根莖和芍藥科植物芍藥的干燥根。羥基多巴胺 （6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO） （批號(hào)G2104010、G2205058，德國Merck 公司）；Beclin1 抗體、Lamp2 抗體、PI3K p85α抗體、Akt1 抗體、p-Akt1 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ抗體、LC3Ⅱ抗體、GAPDH 抗體（批號(hào)GR220243-2、GR270186-4、GR3245955-1、GR240003-94、GR3241584-3、GR133550-7、GR284919-8、GR3183128-17、GR3252679-1、GR217575-73，英國 Abcam 公司）；Goat anti-mouse IgG、Goat anti-rabbit IgG （批號(hào)bst17go4a17h50、bst18a12b18b54，武漢博士德生物工程有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)092221220421，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DAB 顯色試劑盒（批號(hào)2207035，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光液 （批號(hào)AB2109，德國ABP Biosciences 公司）。

1.3 儀器 腦立體定位儀、電動(dòng)顱骨鉆（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Tecnai G2 Spirit 透射電鏡（捷克FEI 公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 芍藥甘草湯的制備 稱取白芍、甘草各62.5 g，加水1 500 mL 浸泡60 min，煎煮30 min 后過濾，再次加水600 mL，第2 次煎煮20 min 后過濾，合并2 次濾液，濃縮至300 mL，備用。

2.2 造模、分組及給藥 隨機(jī)選取20 只大鼠采用左側(cè)紋狀體兩點(diǎn)注射6-羥基多巴胺（6-OHDA） 制備帕金森病模型［8］；假手術(shù)組注射等量生理鹽水；另設(shè)正常組不做任何處理，造模后第4 周，采用APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型是否成功。將造模成功的帕金森病大鼠隨機(jī)分為模型組和芍藥甘草湯組（12 g／kg），每組9 只，連續(xù)灌胃給藥28 d。

2.3 大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測 給藥結(jié)束后，采用APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)，即在各組大鼠的頸背部皮下注射APO（0.5 mg／kg） 誘發(fā)其出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，記錄開始旋轉(zhuǎn)后30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計(jì)算其旋轉(zhuǎn)速度。

2.4 透射電鏡觀察大鼠腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的自噬小體 大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，取腦黑質(zhì)區(qū)組織，立即置于2.5%戊二醛中固定4 h 以上，并于4 ℃保存。將前固定的腦組織用PBS 緩沖液清洗3 次，使用1%四氧化鋨固定2 h，于4 ℃冰箱保存，PBS 緩沖液清洗3 次后，50%、70%、80%和90% 乙醇梯度脫水10 min，置于100%乙醇和丙酮中各脫水2 次，將脫水后的組織置于丙酮和包埋液比例為3 ∶1 的溶液中孵育0.5 h，然后置于丙酮和包埋液比例為1 ∶1 的溶液中孵育4 h，最后置于純包埋液中4 ℃孵育過夜，次日用包埋劑包埋樣品，置于烤箱內(nèi)進(jìn)行聚合，條件為37 ℃，24 h；60 ℃，48 h。用Leica UC7超薄切片機(jī)將以上處理的腦組織樣品切成厚度約100 nm的超薄切片，進(jìn)行醋酸雙氧鈾染色20 min 和檸檬酸鉛染色12 min，最后于透射電鏡下觀察并拍照。

2.5 Western blot 法檢測大鼠腦黑質(zhì)區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取大鼠腦黑質(zhì)區(qū)，提取總蛋白并按照BCA 法檢測總蛋白的濃度，蛋白溶液加入上樣buffer 后，于水浴鍋中煮沸5 min進(jìn)行變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，使用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1 h，TBST 洗膜，于稀釋后的Beclin1、Lamp2、PI3K p85α、Akt1、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ、GAPDH 一抗溶液中4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，使用稀釋后的對(duì)應(yīng)二抗在37 ℃下孵育1 h，TBST 洗膜后，按照ECL 發(fā)光液的操作說明進(jìn)行顯色、曝光，通過Image-Pro Plus 軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 免疫組化法觀察大鼠腦黑質(zhì)區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 深度麻醉大鼠后，進(jìn)行生理鹽水（約100 mL） 和4 ℃、4%多聚甲醛（約200 mL） 灌注，隨后取出大腦的黑質(zhì)區(qū)并置于4%多聚甲醛固定，按照常規(guī)方法進(jìn)行組織包埋和切片。將切片放置于60 ℃恒溫箱中烘烤過夜，次日脫蠟至水，使用0.01 mol／L 枸櫞酸鈉緩沖溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2室溫封閉15 min，PBS 洗滌，5% BSA 封閉液孵育15 min，滴加稀釋后的Beclin1、LC3-Ⅱ、p-Akt、p-mTOR 一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBS 洗滌，隨后滴加聚合HRP 標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，PBS 洗滌，DAB 顯色液染色5～10 min，于顯微鏡下觀察顯色情況，并水洗終止顯色。按照常規(guī)方法進(jìn)行蘇木素復(fù)染、1%鹽酸分化及流水返藍(lán)，然后將切片放入梯度乙醇中進(jìn)行脫水，二甲苯浸泡10 min，最后使用中性樹膠封片，于光鏡下觀察并拍照。每張組織切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，使用Image J 軟件測量陽性染色比例，并進(jìn)行歸一化分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芍藥甘草湯對(duì)帕金森病大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響 給藥結(jié)束之后進(jìn)行APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測，結(jié)果表明，正常組和假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)有效的旋轉(zhuǎn)行為。模型組和芍藥甘草湯組大鼠的有效旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為292±19、128±20，轉(zhuǎn)速分別為9.7、4.3 r／min，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。表明芍藥甘草湯能有效改善帕金森病大鼠的癥狀。

3.2 芍藥甘草湯對(duì)帕金森病大鼠腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元自噬小體形成的影響 如圖1 所示，與正常組比較，假手術(shù)組黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)自噬小體數(shù)量未見明顯改變；與假手術(shù)組比較，模型組黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)自噬小體數(shù)量減少；與模型組比較，芍藥甘草湯組黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)自噬小體數(shù)量增多，表明芍藥甘草湯處理可以有效增加帕金森病大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元自噬小體的形成。

圖1 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)自噬小體形成情況

3.3 芍藥甘草湯對(duì)帕金森病大鼠腦黑質(zhì)區(qū)自噬調(diào)控蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果如圖2、表1 所示，與正常組比較，假手術(shù)組Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥甘草湯組Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)比較（±s，n＝3）

表1 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)Beclin1、Lamp2、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)比較（±s，n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別Beclin1／GAPDHLamp2／GAPDH LC3Ⅱ／LC3Ⅰ正常組0.32±0.030.38±0.041.80±0.13假手術(shù)組0.31±0.050.35±0.061.71±0.16模型組0.08±0.02**0.19±0.02**0.37±0.02**芍藥甘草湯組0.14±0.03＃＃0.33±0.05＃＃1.46±0.05＃＃

圖2 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)Beclin1、Lamp2、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白條帶圖

免疫組化結(jié)果如圖3 所示，正常組、假手術(shù)組、模型組和芍藥甘草湯組Beclin1 蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比值分別為1.00±0.10、1.03±0.09、0.45±0.11、0.87±0.12，LC3Ⅱ蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比值分別為1.00±0.12、0.96±0.11、0.66±0.10、0.93±0.09。模型組Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)較假手術(shù)組降低（P＜0.01）；芍藥甘草湯組Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)較模型組升高（P＜0.01）。免疫組化和Western blot 檢測Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白在各組的變化趨勢一致，表明芍藥甘草湯處理可以有效提高帕金森病大鼠黑質(zhì)區(qū)自噬調(diào)控蛋白的表達(dá)。

圖3 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)Beclin1 和LC3Ⅱ蛋白陽性表達(dá)情況

3.4 芍藥甘草湯對(duì)帕金森病大鼠腦黑質(zhì)區(qū)PI3K／Akt／mTOR 通路的影響 Western blot 結(jié)果如圖4、表2 所示，各組大鼠腦黒質(zhì)區(qū)Akt1 和mTOR 蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05）。與正常組比較，假手術(shù)組PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和p-mTOR／mTOR 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥甘草湯組PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和p-mTOR／mTOR蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（±s，n＝3）

表2 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)PI3K p85α、p-Akt1／Akt1 和pmTOR／mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)比較（±s，n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別PI3K p85α／GAPDH p-Akt1／Akt1 p-mTOR／mTOR正常組0.40±0.080.38±0.020.25±0.03假手術(shù)組0.41±0.130.36±0.020.24±0.05模型組1.78±0.19**0.89±0.08** 1.26±0.11**芍藥甘草湯組0.77±0.15＃＃0.53±0.03＃＃0.81±0.06＃＃

圖4 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)PI3K p85α、Akt1、p-Akt1、mTOR 和p-mTOR 蛋白條帶圖

免疫組化結(jié)果如圖5 所示，正常組、假手術(shù)組、模型組和芍藥甘草湯組p-Akt1 蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比值分別為1.00±0.12、0.98±0.10、1.85±0.13、1.17±0.14，p-mTOR蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞比值分別為1.00±0.14、1.06±0.13、2.06±0.14、1.35±0.15。模型組p-Akt1 和p-mTOR 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組升高（P＜0.01）；芍藥甘草湯組p-Akt1 和pmTOR 蛋白表達(dá)較模型組降低 （P＜0.01）。免疫組化和Western blot 檢測p-Akt1 和p-mTOR 蛋白在各組的變化趨勢一致，表明芍藥甘草湯處理可以有效抑制帕金森病大鼠黑質(zhì)區(qū)PI3K／Akt／mTOR 通路的激活。

圖5 各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)p-Akt1 和p-mTOR 蛋白陽性表達(dá)情況

4 討論

芍藥甘草湯為酸甘化陰之劑，甘草以生陽明之津，芍藥以和太陰之液，其腳即伸，與治療帕金森病的“腳攣急” “肌強(qiáng)直” 臨床癥狀有相似之處，為治療帕金森病肌強(qiáng)直提供了中醫(yī)臨床基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)方芍藥甘草湯治療帕金森病的肌強(qiáng)直癥狀療效顯著［5，10］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯可有效改善帕金森病大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平，提高黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶，緩解肌強(qiáng)直，提高大鼠自主活動(dòng)度［8］。多巴胺能神經(jīng)元自噬能力的降低是導(dǎo)致其變性丟失的重要因素之一［11］。自噬是一種去除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器等物質(zhì)以維持細(xì)胞生存和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞機(jī)制［12］。細(xì)胞自噬水平的改變是帕金森病發(fā)病的關(guān)鍵因素，研究顯示增強(qiáng)自噬對(duì)帕金森病有潛在的治療作用［13-14］。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上探討芍藥甘草湯通過調(diào)節(jié)自噬保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用機(jī)制，以期為芍藥甘草湯的臨床應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。

通過6-OHDA 誘導(dǎo)帕金森病模型是研究帕金森病的最常用動(dòng)物模型之一［15］。APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芍藥甘草湯可改善帕金森病大鼠癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量減少，自噬調(diào)控蛋白Beclin1、Lamp2 表達(dá)及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值降低。Beclin1 在自噬過程中發(fā)揮核心作用，其表達(dá)與自噬程度呈正相關(guān)［16］。LC3 參與自噬的形成，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 （即LC3Ⅰ） 會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w） 膜型（即LC3Ⅱ），LC3Ⅱ升高代表自噬的啟動(dòng)［17］。Lamp2 是自溶酶體成熟的中介，其表達(dá)與自噬程度亦呈正相關(guān)［18］。研究顯示6-OHDA 誘導(dǎo)可抑制大鼠腦黑質(zhì)區(qū)細(xì)胞的自噬能力［19］。芍藥甘草湯組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)則出現(xiàn)了自噬小體數(shù)量增多，自噬調(diào)控蛋白Beclin1、Lamp2 表達(dá)及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值降低的現(xiàn)象，這些結(jié)果提示芍藥甘草湯可抑制6-OHDA 對(duì)大鼠腦黑質(zhì)的影響，促進(jìn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的自噬，進(jìn)而改善帕金森病大鼠的癥狀。

PI3K／Akt／mTOR 通路是調(diào)控自噬的關(guān)鍵信號(hào)通路，當(dāng)該通路被激活時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞自噬能力降低［20］。研究表明抑制PI3K／Akt／mTOR 通路可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用［21］。本研究發(fā)現(xiàn)帕金森病大鼠腦黑質(zhì)PI3K／Akt／mTOR 通路被激活，而芍藥甘草湯處理則可以有效抑制PI3K／Akt／mTOR 通路的活化，表明芍藥甘草湯可能通過抑制PI3K／Akt／mTOR通路增強(qiáng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的自噬能力進(jìn)而改善帕金森病大鼠的癥狀。此外，芍藥及甘草中的一些單體也具有調(diào)控PI3K／Akt／mTOR 通路的作用［22-23］，這些研究豐富了芍藥甘草湯抑制PI3K／Akt／mTOR 通路促進(jìn)自噬的理論依據(jù)。

綜上所述，芍藥甘草湯能增強(qiáng)6-OHDA 誘導(dǎo)的帕金森病大鼠腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的自噬能力，其可能的機(jī)制與抑制PI3K／Akt／mTOR 通路有關(guān)。芍藥甘草湯具有多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的特點(diǎn)［24］，抑制PI3K／Akt／mTOR 通路促進(jìn)自噬可能是芍藥甘草湯發(fā)揮作用的靶點(diǎn)之一。