蔡淑慧，丁夢磊，甘逸夫，王洪蘭，張 雯*，狄留慶*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術研究中心，江蘇 南京 210023）

附子是毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品，有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效［1］，被稱為“回陽救逆第一品藥”，又被譽為“百藥之長”?，F代研究表明，附子主要含有生物堿與多糖類成分，具有強心、抗腫瘤等作用［2-3］。生物堿是附子中研究最多、最具療效的化學成分，該類化合物具有典型的“效-毒” 辨證關系，其含量高低會顯著影響附子藥效與毒性［4-5］。因此，采用適宜純化技術獲取附子生物堿類成分，對其開發(fā)利用具有重要意義。

目前，大孔吸附樹脂法是最常用的生物堿純化手段［6-7］，具有選擇性好、吸附速度快、機械強度高等優(yōu)點［8-9］。然而，該方法也受到諸多因素的影響，如樹脂類型與上樣方案等。因此，優(yōu)化純化參數有利于高效節(jié)能地獲取附子生物堿類成分。星點設計-效應面法［10-11］具有實驗次數少、準確度高、預測性好的優(yōu)勢，廣泛應用于中藥提取與純化。然而，目前星點設計-效應面法尚未應用于附子生物堿類成分純化工藝。本實驗擬采用單因素考察及星點設計-效應面法優(yōu)選大孔樹脂純化附子總生物堿的工藝，以期為附子的物質基礎研究提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 TU-1810PC 型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；PHS-3C 型PH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；CL21R 型微量離心機（美國賽默飛世爾公司）；XP-6 型電子天平（百萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；PA1204B 型電子天平（萬分之一，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黑順片（產地四川綿陽，批號190715）購自亳州市永剛飲片廠有限公司，經南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品。苯甲酰烏頭原堿（批號JBZ-1741）、苯甲酰次烏頭原堿（批號JBZ-0039）、苯甲酰新烏頭原堿（批號JBZ-0032）、次烏頭堿 （批號JBZ-0161）、新烏頭堿（批號JBZ-1314）、烏頭堿（批號JBZ-1270） 對照品均購自南京金益柏生物科技有限公司，純度≥98%。95%乙醇及D101、AB-8 大孔樹脂均購自南京晚晴化玻儀器有限公司；HPD-826、XDA-5、LS-303 大孔樹脂均購自鄭州和成新材料科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，均購自美國Tedia 公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 樣品溶液制備

2.1.1 上樣液 取黑順片中粉（過280 μm 篩） 約200 g，加4 倍量85%乙醇浸泡24 h，濾過，濾液備用，藥渣用4倍量85%乙醇作為溶劑，加熱回流提取4 次，每次2 h，藥渣用少量溶劑洗滌，合并浸漬液、提取液、洗滌液，回收乙醇濃縮至無醇味，加蒸餾水制成質量濃度為1 g／mL 的母液，上柱時根據試驗設計加水稀釋得上樣液。

2.1.2 洗脫液 取經預處理的D101 型大孔樹脂約10 g，分別裝入同樣規(guī)格的玻璃層析柱中，取0.16 g／mL 上樣液50 mL，上柱，體積流量1.5 mL／min，5 BV 蒸餾水清洗雜質，體積流量5 mL／min，8 BV 80%乙醇以1.5 mL／min 體積流量洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，蒸餾水定容至50 mL，即得。

2.2 總生物堿含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取烏頭堿對照品適量，精密稱定，加0.01 mol／L 鹽酸制成每1 mL 含0.111 2 mg 該成分的溶液，即得。

2.2.2 線性關系考察 根據文獻［12］ 方法，以對照品質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸，得方程為A＝0.002 8X-0.002 6 （r＝0.999 0），在22.24～133.44 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.3 測定方法 精密吸取“2.1” 項下上樣液、洗脫液各10 mL，置于分液漏斗中，濃氨水調節(jié)pH 至10～11，二氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并二氯甲烷層，殘渣加0.01 mol／L 鹽酸至10 mL，精密吸取3 mL至分液漏斗中，按“2.2.2” 項下方法測定吸光度，計算總生物堿質量濃度。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 精密度試驗 精密稱取黑順片中粉20 g，按“2.1” 項下方法制備樣品溶液，按“2.2.3” 項下方法測定6 次，測得吸光度RSD 為0.06%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 精密稱取黑順片中粉20 g，按“2.1” 項下方法平行制備洗脫液6 份，按“2.2.3” 項下方法測定，測得生物堿含量RSD 為0.46%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取黑順片中粉20 g，按“2.1” 項下方法制備樣品溶液，于0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 按“2.2.3” 項下方法測定，測得吸光度RSD 為0.12%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 加樣回收率試驗 取總生物堿含量已知的同一份上樣液25 mL，共6 份，精密加入100% 水平烏頭堿對照品，按“2.1” 項下方法制備樣品溶液，按“2.2.3” 項下方法測定，計算回收率。結果，平均加樣回收率為99.42%，RSD 為0.94%。

2.3 單、雙酯型生物堿含量測定

2.3.1 色譜條件 Waters XBridge-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A）-5 mmol／L 醋酸銨（B），梯度洗脫（0～12 min，2%A；12～40 min，2%～28%A；40～60 min，28%～45% A；60～62 min，45%～2% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。各生物堿與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數按苯甲酰新烏頭原堿峰計，應不低于3 000［1］。

圖1 各生物堿HPLC 色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 取各對照品適量，精密稱定，加乙腈制成每1 mL 分別含苯甲酰烏頭原堿399.623 μg、苯甲酰次烏頭原堿39.960 μg、苯甲酰新烏頭原堿12.052 μg、新烏頭堿7.980 μg、次烏頭堿32.034 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 按“2.1” 項下方法制備樣品溶液，14 000 r／min 離心10 min，取上清液，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察 取“2.3.2” 項下對照品溶液適量，乙腈依次稀釋2 倍，在“2.3.1” 色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各生物堿在各自范圍內線性關系良好。

表1 各生物堿線性關系

2.3.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.3.2” 項下對照品溶液適量，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD 分別為2.16%、2.69%、4.48%、3.50%、3.79%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復性試驗 按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量RSD 分別為1.74%、3.11%、4.16%、3.41%、2.25%，表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積RSD 分別為1.37%、50 mL。2.09%、4.83%、2.45%、2.85%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 取各生物堿含量已知的供試品溶液6 份，加入100%對照品溶液適量，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿平均加樣回收率分別為92.21%、99.75%、100.25%、102.34%、98.23%，RSD 分別為2.14%、3.30%、3.98%、4.96%、3.40%。

2.3.5 樣品含量測定 取黑順片中粉適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，平行2 次，計算含量。

2.4 樹脂篩選

2.4.1 預處理 用95%乙醇溶液浸泡樹脂24 h 以保證其充分溶脹，濕法裝柱，95%乙醇淋洗至洗脫液與水混合（比例為1 ∶2） 不呈白色渾濁為止，再用去離子水洗至無醇味，濕態(tài)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 靜態(tài)吸附試驗 稱取預處理后表面干燥的樹脂約1 g，置于150 mL 錐形瓶中，加入10 mg／mL 總堿溶液10 mL，室溫下120 r／min 振蕩吸附24 h，測定吸附后溶液中總生物堿含量，計算吸附率，公式為吸附率＝［（吸附前總生物堿含量-吸附后總生物堿含量）／吸附前總生物堿含量］ ×100%，結果見表2。

表2 樹脂靜態(tài)吸附-解吸附性能測定結果

2.4.3 靜態(tài)解吸附試驗 將上述吸附生物堿的樹脂分離，少量水洗滌后除去水分，加入10 mL 70%乙醇，室溫下120 r／min振蕩脫附24 h，測定洗脫液中總生物堿含量，計算解吸率，公式為解吸率＝［洗脫液中總生物堿含量／（吸附前總生物堿含量-吸附后總生物堿含量）］ ×100%，結果見表2。

由此可知，D101、LS-303 樹脂吸附率均達到80%以上，并且前者吸附率、解吸率更大。因此，選用D101 樹脂進行下一步分離純化。

2.5 單因素試驗

2.5.1 上樣量（動態(tài)吸附曲線） 按“2.4.1” 項下方法濕法裝柱后，取0.1 g／mL 樣品溶液，每10 mL 收集1 個流分，按“2.2.3” 項下方法測定總生物堿含量，以流出液體積為橫坐標（X），流出液中總生物堿濃度為縱坐標（Y），繪制動態(tài)吸附的泄露曲線［7-8］。由圖2A 可知，當上樣液體積為10 mL 時，附子生物堿開始少量泄露，隨著上樣液體積的增大，流出液中總生物堿濃度呈上升趨勢；達到50 mL時，隨著上樣體積增加，流出液總生物堿質量濃度趨于平緩，可能是由于大孔樹脂吸附達到飽和，故確定上樣量為

圖2 單因素試驗結果

2.5.2 上樣液質量濃度 按“2.4.1” 項下方法濕法裝柱后，分別取0.05、0.1、0.25、0.5 g／mL 樣品溶液各100、50、20、10 mL，調節(jié)pH 值至5.0，上柱，體積流量1.5 mL／min，蒸餾水5 BV 清洗雜質，體積流量5 mL／min，收集流出液，按“2.2.3” 項下方法測定總生物堿含量，計算吸附率。由圖2B 可知，當上樣液質量濃度為0.1 g／mL 時，吸附量達到最高，吸附率最大，為98.8%；隨著其進一步升高，吸附量下降，可能是發(fā)生了絮凝和沉淀現象，故選擇上樣液質量濃度為0.1 g／mL。

2.5.3 上樣液pH 值 按“2.4.1” 項下方法濕法裝柱后，取0.1 g／mL 樣品溶液50 mL，調節(jié)pH 值至3.0、5.0、7.0、9.0，上柱，體積流量1.5 mL／min，收集流出液，按“2.2.3” 項下方法測定總生物堿含量，計算吸附率。由圖2C 可知，pH 對于吸附效果影響不大，原液pH 為3.49，可直接上樣，無需調pH 值。

2.5.4 洗脫液體積分數 按“2.4.1” 項下方法濕法裝柱后，取0.1 g／mL 樣品溶液50 mL，上柱，體積流量1.5 mL／min，蒸餾水5 BV 清洗雜質，體積流量5 mL／min，分別用10%、30%、60%、80%乙醇各10 BV 洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，蒸餾水定容，按“2.2.3” 項下方法測定總生物堿含量，計算解吸率。由圖2D 可知，隨著洗脫液體積分數增加解吸率不斷升高，為80%時達到最大值，故選擇其作為最優(yōu)洗脫液體積分數。

2.5.5 洗脫液用量（動態(tài)洗脫曲線） 按“2.4.1” 項下方法濕法裝柱后，取0.1 g／mL 樣品溶液50 mL，上柱，體積流量1.5 mL／min，蒸餾水5 BV 清洗雜質，體積流量5 mL／min，80%乙醇10 BV 洗脫，每1 BV 收集1 個流分，按“2.2.3” 項下方法測定各流分中總生物堿含量，繪制動態(tài)解吸附曲線。由圖2E 可知，洗脫液中總生物堿含量隨乙醇洗脫液體積增加呈先增加后減少的趨勢，為3 BV 時達到最大值；隨著其繼續(xù)增大，生物堿含量開始下降，6 BV 后已經很少，表明總生物堿接近洗脫完全。因此，最佳洗脫體積為6 BV，但因兼顧生物堿得率，還需進一步考察洗脫液用量。

2.6 星點設計-效應面法

2.6.1 設計方案 根據單因素試驗結果，選擇上樣液質量濃度（A）、乙醇體積分數（B）、乙醇洗脫量（C） 作為影響因素，根據星點設計原理，采用三因素五水平試驗，水平用代碼值-α、-1、0、1、α 表示，因素水平見表3。取各質量濃度樣品溶液50 mL，以1.5 mL／min 體積流量上樣，按表3 進行洗脫，回收乙醇，蒸餾水定容，采用酸性染料比色法測定洗脫液中總生物堿含量，HPLC 法測定雙、單酯型生物堿總量，并計算解吸率、純度，公式為純度＝［樣品液中總生物堿的含量／樣品液固含量］ ×100%，其中樣品液固含量參照2020 年版《中國藥典》 通則項下3101 固體總量測定法［13］進行測定。再將表3 中的總生物堿（以烏頭堿計）、雙酯型生物堿和單酯型生物堿總量的數據進行“歸一化”，運用Hassan 法分別對各指標進行數學轉換求“歸一值” （d），公式為d＝（Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），計算總評歸一值（OD），公式為OD＝（d1×d2×d3）1／3，結果見表3。

表3 試驗設計與結果

2.6.2 數據處理 采用Design-Expert 8.0 軟件對表3 中數據進行多元線性回歸、二項式擬合，得多元線性回歸方程為Y＝-1.676-5.566×10-3A+0.026 3B+0.058 3C（r＝0.732 1，P＜0.01），雖然P值通過檢驗，但相關系數過小，模型擬合度不高，預測性較差，而二項式擬合方程為Y＝-7.533+ 10.00A+ 0.178 8B-3.866 × 10-3C-0.035AB-0.022 9AC+6.717×10-4BC-17.02A2-1.079×10-3B2+3.944×10-3C2（r＝0.944 6，P＜0.01），方差分析見表4。

表4 方差分析

由此可知，模型P＜0.01，表明該擬合模型具有顯著性，擬合度R2＝0.944 6，失擬項P＞0.05，說明擬合度很高，誤差小，模型可靠；校正決定系數＝0.894 7，說明模型可信度較高，能解釋89.47%響應值的變化，能較好地擬合真實效應面；一次項B對OD 值有極顯著影響（P＜0.01），C對OD 值有顯著影響（P＜0.05），二次項A2、B2對OD 值有極顯著影響（P＜0.01），交互項AB、AC、BC均不顯著（P＞0.05）。

2.6.3 工藝預測 根據上述二次多項式擬合模型，分別固定一個自變量為中間值，繪制因變量解吸率隨自變量變化的三維效應面圖、二維等高線圖，見圖3。由此可知，乙醇體積分數、乙醇洗脫量的曲線均較陡峭，說明乙醇體積分數對OD 值的影響最顯著。用Point Prediction 進行預測分析，可知最優(yōu)工藝為上樣液質量濃度0.16 g／mL，乙醇體積分數80%，乙醇洗脫量8 BV，OD 值為0.941 3。

圖3 各因素響應面圖

2.6.4 驗證試驗 取0.16 g／mL 樣品溶液50 mL，上柱，體積流量1.5 mL／min，蒸餾水5 BV 清洗雜質，體積流量5 mL／min，8 BV 80%乙醇以1 mL／min 體積流量洗脫，采用酸性染料比色法測定洗脫液中總生物堿含量，HPLC 法測定雙、單酯型生物堿總量，并計算解吸率、純度，平行3 次，取平均值，并計算OD 值。結果，與預測值0.941 3 偏差-7.30%，表明所得擬合方程可較好地描述指標與因素之間的關系，模型合理可靠，預測性好，可進行提取純化，見表5。

表5 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論與結論

在確定評價指標時，在上柱因素考察過程中，考慮到損失率，在飽和時即停止上樣，上樣流出液中生物堿類成分量較低，無法測定單一生物堿的量，因此以總生物堿的吸附率為指標優(yōu)選上柱參數。在洗脫因素考察過程中，本實驗主要是研究總生物堿的富集純化工藝，因此總生物堿在洗脫工藝中占較大的比重，而單一成分在洗脫工藝研究中也占有一定的權重，雙酯型生物堿、單酯型生物堿為附子的主要有效成分，因此選用總生物堿、雙酯型與單酯型生物堿總量的解吸率和純度為指標總評歸一值進行洗脫參數優(yōu)選［14-17］。

本實驗對色譜條件進行了優(yōu)化，考察了Waters XBridge-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Angilent ZORBAXSB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），比較了流動相乙腈-四氫呋喃 （25 ∶15）-0.1 mol／L 醋酸銨、乙腈-40 mmol／L醋酸銨、乙腈-5 mmol／L 醋酸銨對色譜峰分離度的影響，并比較了不同檢測波長下色譜峰數量及峰高，最終確定為Waters XBridge-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-5 mmol／L 醋酸銨梯度洗脫，此時各成分分離度、基線平穩(wěn)、峰形均良好。

本研究通過單因素考察并結合星點設計-效應面法篩選附子生物堿最佳純化工藝，采用紫外吸收光度法及HPLC對生物堿類成分進行含量測定，結合純度進行綜合評價，經驗證本純化工藝穩(wěn)定可行，可為附子的綜合利用提供依據。