郭春燕，胡建燃，李 平，安 婕，張峰碧

（1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 晉中 030619；2.晉中學(xué)院山西特色植物資源應(yīng)用研究中心，山西 晉中 030619）

中華蹄蓋蕨AthyriumsinenseRupr.為蹄蓋蕨科、蹄蓋蕨屬植物，生于海拔1 500～2 000 m 山谷林下，在我國華北、東北、西北等地均有分布，以其根莖及葉柄殘基入藥，具有清熱解毒、止血、殺蟲等功效［1］。隨著人們對蕨類植物化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分為酚類，其中黃酮類化合物具有極強(qiáng)的抗氧化活性，可以清除人體內(nèi)的自由基，延緩衰老、預(yù)防疾病，除此之外，還具有抗病毒、抗腫瘤、免疫激活等多種藥理作用，其在藥品、食品行業(yè)開發(fā)應(yīng)用潛力巨大［2-3］。

目前，有關(guān)蹄蓋蕨科植物的研究報道相對較少，主要集中在物種分類、區(qū)系、資源調(diào)查、形態(tài)結(jié)構(gòu)與栽培方面，其中僅對猴腿蹄蓋蕨［4-5］等少數(shù)蹄蓋蕨科植物進(jìn)行了活性成分提取與分析，還未見中華蹄蓋蕨黃酮提取及其組分分析的相關(guān)研究。因此，本研究以黃酮得率作為指標(biāo)，利用單因素和正交試驗對中華蹄蓋蕨黃酮進(jìn)行提取，獲得最佳的提取條件，并在對提取到的黃酮進(jìn)行最佳純化的基礎(chǔ)上，采用UPLC-Q-TOF-MS 法對其黃酮成分進(jìn)行檢測與分析，以期為中華蹄蓋蕨的深度開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料

中華蹄蓋蕨采自山西省呂梁市交城縣龐泉溝國家級自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系植物實驗室專家鑒定為正品，陰干至恒重后經(jīng)微型植物粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，裝入密封袋中備用。蘆丁對照品（純度＞98%，中國食品藥品檢定研究院）。60～90 目聚酰胺樹脂（江蘇長豐化工有限公司）；NaNO2、Al （NO3）3、NaOH、無水乙醇、α-萘酚、鎂粉、鹽酸為分析純（天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；甲酸、乙腈、甲醇為色譜純（美國Thermo Fisher公司）；水為超純水。

XS105 分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AK-060S超聲波清洗機(jī)（深圳市鈺潔清洗設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-300V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ROB50 純水儀；Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī)［力康國際貿(mào)易（上海）有限公司］；Evolution 260 Bio 紫外分光光度計 （美國Thermo 公司）；安捷倫1290 Infinity 超高效液相色譜儀、安捷倫6545 UHD and Accurate-Mass Q-TOF 質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品20 mg，95%乙醇定容至100 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度為200 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 吸光度測定 吸取對照品溶液2 mL 至10 mL 試管中，加純凈水至5 mL，向試管中加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加入0.3 mL 10% Al （NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min，加入4.4 mL 4% NaOH 溶液，搖勻，靜置12 min，以溶劑為空白，在400～600 nm 波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長510 nm 作為檢測波長。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 向20 mL 試管中加入0、1、2、3、4、5 mL 蘆丁對照品，依次加入純凈水、NaNO2溶液、Al （NO3）3溶液、NaOH 溶液，在510 nm 波長處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.002 9X+0.003 （R2＝0.999 2），在0～100 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 黃酮提取 稱取1.000 g 中華蹄蓋蕨粉末至三角瓶中，按比例加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，超聲（功率380 W） 處理一定時間，待三角瓶中溶液冷卻后，用布氏漏斗抽濾保留濾液，離心棄去沉渣，記錄所得上清液的體積，測定吸光度，計算得率，公式為得率＝（提取液中黃酮質(zhì)量濃度×體積×稀釋倍數(shù)／質(zhì)量） ×106×100%。

2.2.1 單因素試驗 在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，設(shè)定單因素固定水平為料液比1 ∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min；單因素不同水平為料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%，超聲溫度40、50、60、70、80 ℃，超聲時間10、20、30、40、50 min。

2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、料液比（D） 為影響因素，每個因素3 個水平，釆用L9（34） 正交表，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.2.3 驗證試驗 取中華蹄蓋蕨60 目干燥粉末3 份，按正交試驗所得最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，測定提取液中黃酮質(zhì)量濃度，計算得率。

2.3 黃酮純化

2.3.1 純化步驟 按照最優(yōu)工藝提取黃酮，將提取液制成2 mg／mL 溶液。取2.0 g 己預(yù)處理好的60～90 目聚酰胺樹脂，濕法裝入層析柱中，使樹脂表面平齊。緩慢加入上樣液，用純凈水清洗至流出液不帶有顏色，采用Molish 反應(yīng)判斷清洗終點；再用乙醇洗脫，采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)判斷洗脫終點［6］，收集洗脫液，在510 nm 波長處測定吸光度，計算黃酮回收率，公式為回收率＝［（洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度×洗脫液體積）／（上樣液中黃酮初始質(zhì)量濃度×上樣液體積）］ ×100%。

2.3.2 純化條件 取2.0 g 己預(yù)處理好的60～90 目聚酰胺樹脂，濕法裝柱，取2 mg／mL 上樣液25 mL，pH 值為5，緩慢上樣，控制體積流量為2.0 BV／h，接取流出液，每5 mL為1 份，共5 份，在紫外分光光度計上測定吸光度，計算黃酮含量［7］。

在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，設(shè)定單因素固定水平為上樣液pH值5，上樣液質(zhì)量濃度2 mg／mL，洗脫溶劑60%乙醇，洗脫體積流量2.0 BV／h；單因素不同水平為上樣液pH 值3、4、5、6、7，上樣液質(zhì)量濃度1、2、3、4、5 mg／mL，洗脫溶劑50%、60%、70%、80%、90%乙醇，洗脫體積流量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV／h。

2.3.3 驗證試驗 取上樣液3 份，按最優(yōu)工藝進(jìn)行分離純化，計算回收率。

2.4 黃酮成分測定

2.4.1 樣品提取方法 取100 μL 純化后的黃酮提取液至EP 管中，加入300 μL 甲醇（含5 μg／mLL-2-氯-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)），渦旋1 min，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.4.2 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.4.2.1 色譜 Waters XSelect HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈 （B），梯度洗脫 （0～2 min，95% A；5.0 min，65%A；15～17 min，35% A；25～30 min，0）；體積流量0.35 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2.2 質(zhì)譜 氣體溫度325 ℃；干燥氣體積流量10 L／min；霧化器壓力20 psi （1 psi＝6.895 kPa）；毛細(xì)電壓3 500 V；碎裂電壓120 V；skimmer 電壓45 V；采集范圍m／z100～3 000。

2.4.3 化合物定性與定量分析 基于自建數(shù)據(jù)庫及化合物信息公共數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜檢測的一級譜、二級譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析?；衔锝Y(jié)構(gòu)解析參考HMDB［8］、PubChem、METLIN［9］等已有的質(zhì)譜公共數(shù)據(jù)庫。

化合物定量是在獲得不同樣本的化合物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，在R 軟件平臺下，使用XCMS 程序包進(jìn)行峰的識別，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代化合物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正［10］。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA顯著性差異分析（P＜0.05），平行3 次，數(shù)據(jù)以（±s）表示。

3 結(jié)果

3.1 黃酮提取單因素試驗 結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗結(jié)果

當(dāng)料液比為1 ∶10～1 ∶25 時，隨著乙醇體積增加，黃酮溶解度、得率升高；當(dāng)料液比小于1 ∶25 時，黃酮得率提高緩慢，說明乙醇過多時可能造成水溶性大極性雜質(zhì)大量析出，從而影響其得率［11］。

黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而升高，為60%時最高。雖然乙醇體積分?jǐn)?shù)增加有利于黃酮的浸出，但過高時會降低極性大的化合物溶解度，并且有可能將脂溶性物質(zhì)提取出來，從而影響其得率［12］。

黃酮得率隨著超聲溫度增加而升高，為60 ℃時最高，超過60 ℃時反而逐漸降低，說明溫度對黃酮化合物的影響很大，當(dāng)溫度過低時，黃酮浸出率低，會造成提取不完全；溫度過高時，會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而影響其得率［13］。

隨著超聲時間延長，黃酮得率先升后降，為30 min 時最高。雖然延長提取時間有利于植物細(xì)胞壁的分解，黃酮會大量浸出而提高得率，但過長時會導(dǎo)致植物細(xì)胞中多糖、蛋白質(zhì)析出，導(dǎo)致黃酮分解，從而影響其得率［14］。

3.2 黃酮提取正交試驗 結(jié)果見表2，各因素影響程度依次為D＞A＞C＞B，即料液比最大，超聲溫度最??；最優(yōu)工藝為A2B2C1D3，即料液比1 ∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度60 ℃，超聲時間20 min。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果（±s）

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果（±s）

試驗號 A 乙醇體積分?jǐn)?shù)／%B 超聲溫度／℃C 超聲時間／min D 料液比 得率／%15050201 ∶259.65±0.06 25060301 ∶30 11.10±0.10 35070401 ∶35 14.24±0.04 46050301 ∶35 14.36±0.39 56060401 ∶259.81±0.07 66070201 ∶30 11.61±0.21 77050401 ∶30 10.16±0.17 87060201 ∶35 14.47±0.54 97070301 ∶259.40±0.02 K111.66311.39011.9109.620—K211.92711.79311.62010.957—K311.34311.75011.40314.357—R0.5900.4030.5074.737—

3.3 驗證試驗 精密稱取中華蹄蓋蕨60 目干燥粉末1.000 g各3 份，按優(yōu)化工藝進(jìn)行提取，測得其黃酮得率為15.01%，可知該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，見表3。

表3 提取工藝驗證試驗結(jié)果（n＝3）

3.4 黃酮純化 首先對其黃酮水溶液（上樣液） 在層析柱上的泄露情況進(jìn)行初步試驗，測定流出液中黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而計算泄漏量。如圖2 所示，當(dāng)上樣量達(dá)到10 mL時，流出液中含有微量黃酮，說明2.0 g 處理好的60～90目聚酰胺樹脂已達(dá)到飽和狀態(tài)，如果繼續(xù)增加上樣量會造成其大量損失。因此，2 mg／mL 黃酮溶液在該條件下的最佳上樣量為10 mL。

圖2 黃酮泄露曲線

在上樣液體積10 mL，處理好的聚酰胺樹脂用量2.0 g條件下，分別對上樣液pH 值、上樣質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫體積流量進(jìn)行考察，結(jié)果見圖3。

圖3 各因素對中華蹄蓋蕨黃酮回收率的影響

黃酮回收率隨上樣液pH 值增加而先升后降，當(dāng)pH 值為3～4 時，由于黃酮類化合物在強(qiáng)酸條件下可能會轉(zhuǎn)變?yōu)檠瘥}，不利于聚酰胺樹脂的吸附［15］，因此其回收率較低。當(dāng)pH 值（pH＞5） 高于黃酮類化合物的pKa值時，它大多以鹽的形式存在，不易被吸附，回收率降低；當(dāng)pH 值為5時，黃酮類化合物以游離形式存在，易被吸附，回收率高。

當(dāng)上樣質(zhì)量濃度低于2 mg／mL 時，黃酮被充分吸附在聚酰胺樹脂上，不利于后期洗脫，導(dǎo)致其回收率較低；為2 mg／mL時，聚酰胺樹脂吸附飽和，黃酮回收率最高；大于2 mg／mL 時，黃酮不能完全被吸附［16］，用純凈水沖洗時不僅除去了上樣液中的雜質(zhì)，也會將未被吸附的該成分除去，致使其回收率下降。

黃酮回收率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而升高，為70%時最高，此時黃酮極性與70%乙醇相近，有利于其從聚酰胺樹脂上解吸下來［17］；但超過70% 時會將大量雜質(zhì)洗脫下來，導(dǎo)致黃酮回收率有所下降。

當(dāng)洗脫體積流量為2.0 BV／h 時，黃酮回收率最高；當(dāng)其加快或減慢時，該成分回收率較低。體積流量緩慢時，洗脫力度不夠；體積流量太快時，洗脫時間縮短，黃酮未能被乙醇洗脫下來，導(dǎo)致其回收率降低［18］。

綜上所述，最優(yōu)純化工藝為上樣液pH 值為5，上樣質(zhì)量濃度2 mg／mL，70%乙醇洗脫，洗脫體積流量2.0 BV／h。

3.5 黃酮純化條件的驗證 取10 mL 2 mg／mL 上樣液各3份，按優(yōu)化工藝在裝有2.0 g 處理好的聚酰胺樹脂層析柱上進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表4，可知該工藝穩(wěn)定可行。另外，純化后的溶液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，粉末中黃酮含量為70.32%，比純化前提高25.64%。

表4 純化工藝驗證試驗結(jié)果（n＝3）

3.6 黃酮成分分析 在負(fù)離子模式下，黃酮類化合物得到了較好的分離，見圖4，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出其中9 個色譜峰所對應(yīng)的化合物。由表5 可知，中華蹄蓋蕨含有針依瓦菊素、沒食子兒茶素、櫻桃苷-4″，6″-二-O-沒食子酸酯、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、黃芪黃酮、棕鱗矢車菊黃酮素、洋槐黃素、3-羥基-8，9-二甲氧基香豆雌酚、肉豆蔻酚C 這9 種黃酮類化合物，其中黃芪黃酮、針依瓦菊素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量較高。

圖4 中華蹄蓋蕨黃酮TIC 色譜圖

表5 中華蹄蓋蕨黃酮鑒定結(jié)果

4 討論

本研究采用超聲波輔助乙醇法對中華蹄蓋蕨黃酮進(jìn)行提取，在最佳提取條件下，中華蹄蓋蕨黃酮的得率為15.01%。本實驗結(jié)果與同屬猴腿蹄蓋蕨黃酮得率接近［20］，表明該提取方法及條件準(zhǔn)確、可行。黃酮提取液經(jīng)聚酰胺樹脂層析純化后，所得干粉中黃酮純度提高了25.64%，說明聚酰胺樹脂對中華蹄蓋蕨黃酮具有良好的吸附性，可有效純化其黃酮。超聲波輔助乙醇提取法與聚酰胺樹脂純化法不僅具備操作簡單、設(shè)備成本低、效率高、穩(wěn)定性佳等優(yōu)點，而且所得黃酮產(chǎn)品純度高，無重金屬、有機(jī)溶劑等毒性物質(zhì)的殘留［21］。從結(jié)果來看，這2 種方法是目前黃酮提取純化較好的方法。

UPLC-Q-TOF-MS 法對復(fù)雜樣品具有高分離能力、高選擇性、高靈敏度、可提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)成分的解析中［22-23］。本研究首次采用該技術(shù)分析中華蹄蓋蕨黃酮的主要成分。通過色譜的分離及質(zhì)譜的檢測，鑒定出中華蹄蓋蕨9 個色譜峰的化學(xué)成分，其中黃芪黃酮、針依瓦菊素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量較高。由于蕨類植物活性成分相關(guān)研究較少，目前僅發(fā)現(xiàn)猴腿蹄蓋蕨、劍葉鳳尾蕨和闊葉鳳尾蕨含有槲皮素-7-O-葡萄糖苷，其他8 種黃酮類化合物未見報道。中華蹄蓋蕨黃酮成分復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步的深入解析。