仝洺慧，朱 越，李佳凝，王 慧，何 妍，王一男

（徐州醫(yī)科大學(xué)新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004）

黃連為毛莨科植物黃連CoptischinensisFranch.的根莖，具有保護(hù)心腦血管、降血糖、抗炎、抗腫瘤等作用，其主要藥用成分為生物堿類［1-3］。2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定，黃連堿、黃連素、巴馬汀等為黃連指標(biāo)性成分［4］。傳統(tǒng)萃取黃連中生物堿的方法有超聲波法、回流法、冷浸法、輔助酶法等［5-7］。存在萃取效率不高、萃取時(shí)程過長(zhǎng)且環(huán)境不友好等缺點(diǎn)，因此探尋一種綠色、高效的黃連生物堿萃取技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；AB265-S 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VS-Tenoe 掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI 公司）；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；BT25S 電子分析天平［賽多利斯（北京） 生物科技有限公司］；TGL-16C離心機(jī)（上海安亭儀器有限公司）；B-220 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E 超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9240A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃連購(gòu)自徐州市康源大藥房，批號(hào)190903，經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)張春平副教授鑒定為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖。鹽酸巴馬?。ㄘ浱?hào)S0422AS，純度≥99.9%）、黃連素（貨號(hào)F0126AS，純度≥99.9%）、藥根堿（貨號(hào)S0913AS，純度≥99.9%） 對(duì)照品，氯化膽堿、甜菜堿、脯氨酸、葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素為分析純（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。甲醇（美國(guó)Fisher 公司）；冰醋酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水。

2 方法

2.1 低共熔溶劑制備 取氯化膽堿、甜菜堿、葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素適量，按照一定比例置于燒杯中，并加入固定比例的水以降低黏度，在80 ℃水浴下加熱并攪拌，直至燒杯中形成均一的液體，冷卻轉(zhuǎn)移，避光保存。初次共合成10 組低共熔溶劑，見表1，氫鍵受體-氫鍵供體比例1 ∶2，含水量20%。

表1 低共熔溶劑類型

2.2 低共熔溶劑對(duì)黃連生物堿成分的提取 取黃連適量干燥30 min，用球磨粉碎機(jī)粉碎15 min，粉末過80 目篩，精密稱取黃連粉末250 mg，置于15 mL EP 管中，加入一定體積配置好的低共熔溶劑10 mL，混合均勻后，超聲提取30 min，待EP 管中溶液冷卻至室溫，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，13 000 r／min 離心10 min，取上清液，即為黃連粗提取液。同法采用甲醇、水對(duì)黃連中的生物堿成分進(jìn)行提取。

2.3 低共熔溶劑的紅外光譜掃描 低共熔溶劑單體和合成后的溶劑通過KBr 壓片法或KBr 薄片直接測(cè)定法進(jìn)行紅外光譜掃描，波長(zhǎng)掃描范圍4 700～340 cm-1；掃描次數(shù)20；變跡函數(shù)Happ-Genze。

2.4 黃連粉末提取前后掃描電子顯微鏡檢測(cè) 取不同溶劑提取后的黃連粉末，分散后載于測(cè)試銅板上，采用掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察黃連粉末經(jīng)過提取前后的顯微結(jié)構(gòu)變化。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 Universil XB C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相2 mmol／L 三乙胺（pH＝9.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，25%～70%B）；體積流量0.5 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量2 μL。

在描述和學(xué)校的關(guān)系時(shí)，59.03%的大學(xué)生持積極情感態(tài)度，以強(qiáng)調(diào)學(xué)校給其帶來的輕松、愉悅的情感體驗(yàn)為價(jià)值取向；而40.97%的大學(xué)生則持消極情感態(tài)度，以強(qiáng)調(diào)學(xué)校給其帶來的禁錮、痛苦的情感體驗(yàn)為價(jià)值取向，所占比例較大。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取藥根堿、巴馬汀、黃連素對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL 的貯備液，精密量取適量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含藥根堿（2、5、10、50、80、100 μg／mL）、巴馬汀（4、10、20、100、160、200 μg／mL）、黃連素 （20、50、100、500、800、1 000 μg／mL） 的溶液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.5.3 供試品溶液制備 取“2.2” 項(xiàng)下粗提取液適量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，加水稀釋5 倍，即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，藥根堿、巴馬汀、黃連素與其他成分均達(dá)到基線分離，并且分離度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.6.2 線性關(guān)系考察 取“2.5.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，以S／N＝3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，S／N＝10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取“2.5.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，質(zhì)量濃度分別為藥根堿50 μg／mL、巴馬汀80 μg／mL、黃連素400 μg／mL，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得藥根堿、巴馬汀、黃連素峰面積RSD 分別為1.52%、1.42%，1.18%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃連粉末的甜菜堿-乳酸（1 ∶3）提取液，平行6 份，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得藥根堿、巴馬汀、黃連素含量RSD 分別為2.18%、2.51%、2.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 低共熔溶劑9 份，加入“2.5.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.5.3” 項(xiàng)下方法制備低、中、高水平（80%、100%、120%） 供試品溶液各3 份，在“2.5.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，藥根堿回收率為97.7%～102.7%，RSD ≤2.2%；巴馬汀回收率為97.9%～98.8%，RSD≤2.3%；黃連素回收率為98.2%～100.1%，RSD≤2.1%。

3 結(jié)果

3.1 低共熔溶劑選擇 以藥根堿、巴馬汀、黃連素總含量為計(jì)算指標(biāo)，比較不同低共熔溶劑與傳統(tǒng)溶劑提取效率的差異，結(jié)果見圖2。由此可知，甜菜堿-乳酸（1 ∶2） 提取總生物堿含量的效率最高，且高于傳統(tǒng)的甲醇、水提取的方法，所以選取甜菜堿-甘油為提取黃連總生物堿的低共熔溶劑。

圖2 黃連中總生物堿成分經(jīng)過不同溶劑提取后的總含量

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 低共熔溶劑比例 篩選出提取率最高的低共熔溶劑甜菜堿-乳酸后，合成不同比例的低共熔溶劑（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4）。隨著甘油比例升高，提取生物堿的量升高，在1 ∶4 時(shí)下降，結(jié)果見圖3A。因此，選擇甜菜堿與乳酸比例1 ∶3 作為最佳水平。

圖3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 低共熔溶劑含水量 含水量具有調(diào)節(jié)低共熔溶劑黏度、極性作用［11-12］。固定提取時(shí)間30 min，料液比15 ∶1，考察不同比例水（0、10%、20%、30%、40%） 對(duì)黃連生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖3B。隨著水比例增加生物堿含量升高，在30%時(shí)最高，再增加時(shí)反而下降。因此，選擇30%作為水比例最佳水平。

3.2.3 料液比 低共熔溶劑的體積大小決定了藥材粉末是否能充分浸潤(rùn)、目標(biāo)化合物能否有效溶出［13］。固定水比例20%，提取時(shí)間30 min，考察不同料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30） 對(duì)黃連生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖3C。隨著料液比增加，藥材充分浸潤(rùn)，生物堿提取率不斷升高，在1 ∶20 時(shí)達(dá)到最大值，再增加時(shí)變化不大。因此，選擇1 ∶20 作為料液比最佳水平。

3.2.4 提取時(shí)間 在一定時(shí)間段內(nèi)，活性成分溶出率隨著時(shí)間的增加而增加，然而達(dá)到一定時(shí)間后，溶液體系滲透壓達(dá)到平衡時(shí)溶出率變化不大［14-15］。固定提取水比例30%，料液比20 ∶ 1，考察不同提取時(shí)間 （10、20、30、40、50 min） 對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖3D。在30 min 內(nèi)，生物堿提取率隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)無明顯變化。從節(jié)省時(shí)間和能源角度考慮，選擇30 min 作為提取時(shí)間最佳水平。

綜上所述，同等條件下實(shí)驗(yàn)中合成的低共熔溶劑對(duì)黃連中生物堿類化合物的提取優(yōu)于傳統(tǒng)的水提取法、醇提取法。經(jīng)過提取試驗(yàn)優(yōu)化，黃連總生物堿優(yōu)化后的最終提取工藝為甜菜堿與乳酸比例1 ∶3，低共熔溶劑含水量30%，料液比1 ∶20，提取時(shí)間30 min。

3.3 低共熔溶劑的紅外光譜掃描 對(duì)甜菜堿通過KBr 壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描，乳酸與合成的甜菜堿-乳酸低共熔溶劑采用KBr 薄片直接測(cè)定法進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 低共熔溶劑成分紅外光譜圖

由此可知，在低共熔溶劑紅外譜中均可觀察到甜菜堿和乳酸的特征吸收峰。乳酸可觀察到較寬的O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰。甜菜堿-乳酸（1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4） 的O-H 伸縮振動(dòng)分別為3 389、3 381、3 377 cm-1，羥基基團(tuán)的紅外特征波長(zhǎng)發(fā)生位移表明合成的甜菜堿-乳酸低共熔溶劑中氫鍵的形成。甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 的羥基吸收峰比其他組的吸收峰更寬、強(qiáng)度更強(qiáng)，表明甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 中氫鍵形成的數(shù)量最多。

3.4 黃連提取前后SEM 檢測(cè) 未經(jīng)提取的黃連粉末可觀察到較為完整的黃連粉末顆粒結(jié)構(gòu)（圖5A）。經(jīng)過不同溶劑作為溶出介質(zhì)的超聲提取后，黃連粉末顆粒遭到不同程度的破壞。黃連植物細(xì)胞和細(xì)胞壁破壞越嚴(yán)重，則黃連中有效成分釋放越多。經(jīng)過甲醇提取后，黃連粉末顆粒表面可觀察到致密細(xì)孔（圖5B）；經(jīng)過水提取后，黃連粉末顆粒表面可觀察到較為疏松的細(xì)孔（圖5C）；經(jīng)過甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 提取后，黃連粉末顆粒破壞較為嚴(yán)重，可觀察到較大空洞（圖5D）。

圖5 黃連粉末提取前后掃描電鏡圖

4 結(jié)論

低共熔溶劑作為一種新型類離子溶劑，它的熔點(diǎn)明顯低于各組分物質(zhì)的熔點(diǎn)，大多數(shù)季銨鹽與氫鍵供體形成的低共熔溶劑的密度通常略大于水的密度，且低共熔溶劑的揮發(fā)性低，被萃取的物質(zhì)相對(duì)而言難于揮發(fā)，熱穩(wěn)定性好，具有超分子結(jié)構(gòu)，紅外圖譜證實(shí)低共熔溶劑分子間存在較強(qiáng)的氫鍵并能與水發(fā)生強(qiáng)烈作用，對(duì)極性和弱極性物質(zhì)溶解性強(qiáng)于普通溶劑。同時(shí)，低共熔溶劑與多數(shù)離子液體類似，具有低飽和蒸汽壓并且能夠調(diào)節(jié)物質(zhì)的選擇性和極性，因此，在提取黃連中生物堿類化合物時(shí)，能提高溶解度，在超聲輔助下能增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的破壞力，比水提取法和醇提取法的效率更高。且低共熔溶劑的黏度隨著溫度的降低而升高，合成時(shí)溫度下的黏度高于室溫下的黏度，甜菜堿與乳酸按1 ∶3 比例合成的低共熔溶劑在室溫下比其它的低共熔溶劑較低，液體流動(dòng)性較好，因此在提取效率上比合成的其它低共熔溶劑的提取效率高。

本研究以用氯化膽堿、甜菜堿、脯氨酸為氫鍵受體，D-果糖、檸檬酸、L-蘋果酸、甘油、DL-乳酸、木糖醇、尿素為氫鍵供體合成的低共熔溶劑，對(duì)黃連中生物堿類化合物進(jìn)行提取，同時(shí)與水提取法和醇提取法進(jìn)行了對(duì)比。通過HPLC 法進(jìn)行提取物的含量測(cè)定，紅外光譜對(duì)合成的低共熔溶劑的官能團(tuán)進(jìn)行表征，同時(shí)通過單因素考察比較低共熔溶劑兩組分摩爾比例、提取時(shí)的時(shí)間、低共熔溶劑含水的比例、料液比對(duì)黃連生物堿提取效率的影響。黃連總生物堿優(yōu)化后的最終提取工藝為甜菜堿與乳酸比例1 ∶3，低共熔溶劑含水量30%，料液比1 ∶20，提取時(shí)間30 min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的低共熔溶劑對(duì)黃連中生物堿類化合物的提取優(yōu)于傳統(tǒng)的水提取法和醇提取法。且合成的低共熔溶劑綠色，快速便捷，成本比傳統(tǒng)離子溶劑低，應(yīng)用前景更為廣闊。因此，低共熔溶劑可用于對(duì)黃連中生物堿類化合物的提取。