黎廷楷，鄒 娟，趙旭萍，楊 菁，張敬杰，何 康，孫宜春，李慧馨，劉亞華*

[1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)藥集團(tuán)（貴州） 同濟(jì)堂制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550009]

大蝎子草Girardiniadiversifolia（Link） Friis 為蕁麻科蝎子草屬多年生草本植物［1］，又名掌葉蝎子草［2］、紅活麻［3］、虎掌蕁麻［4］，主要分布于湖北、四川、貴州、云南等地［5］，可用于治療銀屑?。?］、咳嗽痰多、水腫、瘡毒［5］、丘疹、濕疹、蕁麻疹［6］等疾病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其含有三萜，甾體，黃酮，揮發(fā)油等成分［7-10］，具有抗炎鎮(zhèn)痛［11-13］、抗風(fēng)濕［14］、抗菌［15］等作用。大蝎子草目前僅在《全國(guó)中草藥匯編》［5］中有收載，但僅有其別名、來(lái)源、形態(tài)特征、生境分布、采集加工、性味功能、主治用法等，缺少TLC 鑒別、含量測(cè)定等相關(guān)質(zhì)量控制內(nèi)容，僅有單獨(dú)成分的含量作為質(zhì)控方法［9］，專屬性差，很難有效控制其質(zhì)量。因此，為提高其用藥質(zhì)量，迫切需要對(duì)該藥材建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

鑒于此，本研究依據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》及《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)》 中相關(guān)規(guī)定對(duì)大蝎子草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行研究；并對(duì)大蝎子草進(jìn)行TLC 鑒別，采用HPLC 法建立大蝎子草藥材的指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行主成分分析及聚類分析，旨在建立大蝎子草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為大蝎子草藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，以便更好地開發(fā)和利用該藥材。

1 材料

LC-2030C 型高效液相色譜儀 （日本島津公司）；Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國(guó)Agilent 公司）；JA2003 型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；OSB-2200 型油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHZ-DIII 型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SK8210HP 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；高效硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）；GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；點(diǎn)樣毛細(xì)管（上海壘固儀器有限公司）；ZF-7 型暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

秦皮素、對(duì)羥基肉桂酸、紫云英苷、木犀草素、芹菜素對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%）；東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；甲酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

大蝎子草來(lái)源見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳之坤副教授鑒定來(lái)源為蕁麻科蝎子草屬大蝎子草Girardiniadiversifolia（Link） Friis。

表1 樣品信息Tab．1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別 精密稱取大蝎子草粉末4 g，加入95%乙醇50 mL，回流提取2 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)尤?.5%鹽酸30 mL 超聲溶解，放冷，加石油醚萃取3 次，每次15 mL，棄去石油醚層。再加乙酸乙酯萃取3 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，加水洗滌至中性，經(jīng)放有無(wú)水硫酸鈉2 g 的濾紙過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)尤? mL 乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，配成每1 mL 含有0.02 mg 東莨菪內(nèi)酯的乙酸乙酯溶液，即為對(duì)照品溶液。按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則0502［16］，分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇（6 ∶2 ∶1） 為展開劑，展開，取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm） 下檢視。結(jié)果，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 大蝎子草薄層色譜圖Fig．1 TLC chromatograms of G．diversifolia

2.2 水分、灰分、浸出物檢查 采用《中國(guó)藥典》 2020 年版第四部通則0832 水分測(cè)定法第二法烘干法測(cè)定水分；采用通則2302 灰分測(cè)定法測(cè)定灰分及酸不溶性灰分；采用通則2201 項(xiàng)下水溶性浸出物項(xiàng)熱浸法，以水作溶劑，測(cè)定水溶性浸出物［16］。結(jié)果見表2。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，參考2020 年版《中國(guó)藥典》［17］，建議大蝎子草水分為不得過(guò)13.0%，總灰分限度不得過(guò)21.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)5.00%，浸出物不得少于14.0%。

表2 大蝎子草的水分、灰分、浸出物含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab．2 Results of content determination for water，ash and extract of G．diversifolia （%）

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷對(duì)照品適量，加入甲醇，逐級(jí)稀釋得到0.2 mg／mL、0.04 mg／mL、8 μg／mL、1.6 μg／mL、0.32 μg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取大蝎子草粉末1 g，置100 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 60%甲醇，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～8% B；15～45 min，8%～16% B；45～75 min，16%～30% B，75～95 min，30%～47%B；95～100 min，47%B）；體積流量1.2 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取大蝎子草粉末（S1） 適量，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得各色譜圖的相似度均大于0.98，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 小于0.5%，相對(duì)峰面積RSD 小于1%，表明儀器精密性良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各色譜圖的相似度均大于0.97，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 小于0.4%，相對(duì)峰面積RSD 小于2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大蝎子草粉末（S1） 適量，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.05%～0.49%，相對(duì)峰面積RSD 為0.05%～1.5%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜結(jié)果分析

2.6.1 HPLC 指紋圖譜的建立與峰的指認(rèn) 將13批大大蝎子草粉末按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC 色譜圖。將各色譜圖以AIA 格式導(dǎo)入相似度軟件，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)匹配，見圖2，共標(biāo)定9 個(gè)共有峰。以所有樣品共有的1 號(hào)色譜峰為參照峰，以其保留時(shí)間和峰面積為1。通過(guò)與對(duì)照品（圖3） 進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)3 號(hào)峰為對(duì)羥基肉桂酸，4號(hào)峰為東莨菪內(nèi)酯，6 號(hào)峰為紫云英苷。

圖2 大蝎子草HPLC 指紋圖譜Fig．2 HPLC fingerprints of G．diversifolia

圖3 對(duì)照品溶液HPLC 色譜圖Fig．3 HPLC chromatograms of reference solutions

2.6.2 相似度評(píng)價(jià) 設(shè)定S1 為參照譜，采用多點(diǎn)校正，時(shí)間窗寬度為0.5，中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，得出各色譜圖的相似度。結(jié)果顯示，各批大蝎子草相似度依次為0.916、0.986、0.989、0.985、0.995、0.982、0.994、0.950、0.980、0.971、0.989、0.991、0.991，在0.916～0.995 之間，從大蝎子草指紋圖譜可知，根據(jù)產(chǎn)地分布的不同其所含成分有差異，其中貴州省貴陽(yáng)市黨武鎮(zhèn)龍井村、貴州省六盤水市六枝特區(qū)平寨的差異最為明顯。

2.6.3 聚類分析 將13 批大蝎子草指紋圖譜中的9 個(gè)共有峰峰面積z-score 標(biāo)準(zhǔn)化。形成13×9 階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類結(jié)果見圖4。當(dāng)歐式平方距離為25 時(shí)，可分為2 類，S1 （省貴陽(yáng)市黨武鎮(zhèn)龍井村）、S8 （貴州省六盤水市六枝特區(qū)平寨） 聚為一類，其余聚為一類；當(dāng)歐式平方距離為20 時(shí)，可分為3 類，S1、S8 聚為一類、S2～S4 聚為一類，其余聚為一類。

圖4 大蝎子草聚類分析結(jié)果Fig．4 Results of cluster analysis for G．diversifolia

2.6.4 主成分分析 將13 批樣品指紋圖譜中的9個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件進(jìn)行主成分分析，以特征值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)得到3 種主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.246%，見表3。采用正交性旋轉(zhuǎn)法，旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣見表4，得分系數(shù)矩陣見表5。通過(guò)Origin 軟件做主成分分析得分圖，見圖5。由此可知，7～9 號(hào)共有峰對(duì)主成分1 具有較大的貢獻(xiàn)；2～4 號(hào)共有峰對(duì)主成分2 具有較大的貢獻(xiàn)，且4 號(hào)共有峰與主成分2 呈負(fù)相關(guān)；1、4、6號(hào)共有峰對(duì)主成分3 具有較大的貢獻(xiàn)。

圖5 大蝎子草主成分分析得分圖Fig．5 Score diagram of principal compounds analysis for G．diversifolia

表3 大蝎子草主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab．3 Principal compounds eigenvalues and variance contribution rates of G．diversifolia

表4 大蝎子草旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣Tab．4 Composition matrix of G．diversifolia after rotation

表5 大蝎子草主成分得分系數(shù)矩陣Tab．5 Score coefficient matrix of principal compounds of G．diversifolia

2.6.5 基于主成分分析建立貴州大蝎子草的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)模型 由表3、5 可知，選擇Z1、Z2、Z3代表3 種主成分作為13 批大蝎子草所表達(dá)的成分信息，建立大蝎子草品質(zhì)的評(píng)價(jià)模型，得出3種主成分的關(guān)系表達(dá)式分別為Z1＝0.001X1-0.029X2-0.012X3-0.104X4+0.238X5+0.115X6+0.245X7+ 0.279X8+ 0.265X9，Z2＝-0.095X1+0.406X2+0.436X3-0.224X4+0.182X5+0.103X6-0.061X7-0.029X8-0.045X9，Z3＝0.427X1-0.030X2-0.149X3+0.341X4+0.193X5+0.371X6-0.059X7+0.058X8。將Z1、Z2、Z3與所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率做內(nèi)積，得到大蝎子草質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)函數(shù)綜合得分 （Z） 的表達(dá)式為Z＝（42.916Z1+27.8Z2+18.531Z3）／89.246。貴州不同產(chǎn)地大蝎子草得分值及排序見表6。

表6 大蝎子草得分值及排序Tab．6 Score values and ranking table of G．diversifolia

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表7，可知各成分線性關(guān)系良好。

表7 各成分線性關(guān)系Tab．7 Linear relationships of various constituents

2.7.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取大蝎子草粉末（S1） 1 g，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為0.48%、0.32%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取大蝎子草粉末（S1） 1 g，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.13%、0.58%、0.31%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.59%、0.52%、0.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，分別加入適量對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷對(duì)照品，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷平均加樣回收率 （RSD） 為101.90% （1.25%）、96.60% （2.13%）、95.10%（2.42%）。

2.7.6 樣品含量測(cè)定 取13 批大蝎子草各1 g，按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表8。由此可知，對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷的平均含量分別為0.060 5、0.021 6、0.124 3 mg／g。結(jié)合2020 年版 《中國(guó)藥典》［17］，選取含量最高的化學(xué)成分紫云英苷做含量限定，即紫云英苷含量不得少于0.01%。

表8 大蝎子草含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab．8 Results of content determination for G．diversifolia（mg／g）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選 本研究考察了提取溶劑、純化溶劑、展開劑、點(diǎn)樣量，并且通過(guò)薄層板、溫度、濕度、展開劑比例、點(diǎn)樣方式對(duì)其耐用性進(jìn)行考察，同時(shí)以對(duì)照品與不同批次、同一批次不同展開劑、不同展開比例對(duì)專屬性進(jìn)行考察，結(jié)果該方法具有良好的耐用性及專屬性。最終確定了大蝎子草的TLC 展開條件。

3.2 色譜條件的選擇 本研究分別考察了流動(dòng)相（乙腈-水、甲醇-0.1% 甲酸水、乙腈-0.1% 甲酸水）、檢測(cè)波長(zhǎng)（254、260、290 nm）、柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.8、1.0、1.2 mL／min），結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，體積流量1.2 mL／min，柱溫30 ℃時(shí)色譜峰較多，且色譜峰峰形及分離效果較好。

3.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草 本研究對(duì)13 批不同產(chǎn)地的大蝎子草進(jìn)行含量測(cè)定，初步擬定大蝎子草水分不得過(guò)13.0%，總灰分不得過(guò)21.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)5.0%，水溶性浸出物（熱浸法） 含量不得少于14.0%；并且以東莨菪內(nèi)酯為對(duì)照建立TLC鑒別方法，對(duì)照品與雜質(zhì)分離度良好，供試品色譜與對(duì)照品相應(yīng)位置顯相同的熒光斑點(diǎn)。

3.4 指紋圖譜及含量測(cè)定 中藥指紋圖譜是評(píng)價(jià)中藥最有效的方法之一［18］。本研究對(duì)13 批大蝎子草藥材建立指紋圖譜，共確定9 個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，共確定了3 種成分。并且通過(guò)指紋圖譜相似度軟件分析，13 批大蝎子草相似度在0.916～0.995 之間，表明不同地區(qū)大蝎子草所含成分存在差異性。聚類分析中，S1、S8 先被分出來(lái)聚為一類，其余樣品聚為一類；S2～S4樣品被分出來(lái)聚為一類，說(shuō)明不同地域之間大蝎子草的成分差異較大。課題組從大蝎子草中分離得到了對(duì)羥基肉桂酸，紫云英苷、東莨菪內(nèi)酯等成分，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理活性［19-23］。因此，結(jié)合大蝎子草的功效，可將上述成分作為指標(biāo)性成分以控制大蝎子草的質(zhì)量。結(jié)果顯示，對(duì)羥基肉桂酸、東莨菪內(nèi)酯、紫云英苷的平均含量分別為0.060 5、0.021 6、0.124 3 mg／g。結(jié)合2020 年版《中國(guó)藥典》 最終選取含量最高的化學(xué)成分紫云英苷做大蝎子草的含量限定，即紫云英苷含量不得少于0.01%。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究對(duì)大蝎子草藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別和水分、灰分、浸出物測(cè)定，補(bǔ)充完善并且擬定了大蝎子草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，并且利用指紋圖譜數(shù)據(jù)分析方法結(jié)合主成分分析及聚類分析對(duì)不同產(chǎn)地大蝎子草藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)，可為建立大蝎子草藥材整體性質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供參考；同時(shí)本次研究促進(jìn)了大蝎子草的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的提升，有利于推動(dòng)其資源的開發(fā)與應(yīng)用。