陳文莉，李 蕊，陳瑞鑫，郭佳晨，蔣桂華

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)國學(xué)院，四川 成都 611137）

白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫味辛，歸胃、肺、大腸經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛等功效，臨床常用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛等癥［1］。白芷富含揮發(fā)油類、香豆素類、多糖類、黃酮類、生物堿等成分［2-4］?，F(xiàn)代研究表明，白芷及其主要活性成分對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病如驚厥、偏頭痛、抑郁、止疼等有較好的緩解或治療作用［5-7］。

2020 年版《中國藥典》 收載的白芷成方制劑有八十多個(gè)，《中醫(yī)方劑大辭典》 中收錄的白芷方劑高達(dá)3 887 個(gè)［8］。目前市場(chǎng)上的白芷按產(chǎn)地主要分為川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳白芷；其中川白芷的產(chǎn)量較大，質(zhì)量上乘；杭白芷近年來基本不再種植；祁白芷、禹白芷產(chǎn)量較小主要供地方使用；亳白芷近年發(fā)展迅猛，產(chǎn)量占有較大，市場(chǎng)上多做香料使用。白芷產(chǎn)地加工方式多為硫磺熏蒸，具有易干燥、不易生蟲、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)易等優(yōu)勢(shì)。但現(xiàn)有研究表明，硫磺熏蒸后藥材有效成分含量損失、藥效降低、藥材質(zhì)量受到嚴(yán)重影響［9-11］。2020年版《中國藥典》 規(guī)定白芷二氧化硫殘留量不得超過150 mg／kg，但課題組前期調(diào)研一百余批白芷樣品后發(fā)現(xiàn)，熏硫白芷二氧化硫殘留量差異較大，除2 批藥材符合規(guī)定外，其余樣品的二氧化硫殘留量超過規(guī)定幾倍甚至十幾倍，這可能是不同熏硫程度所導(dǎo)致。2020 年版《中國藥典》 僅以歐前胡素含量作為白芷質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)較為單一，無法體現(xiàn)不同熏硫白芷藥材的內(nèi)在質(zhì)量差異［12］。

綜上所述，白芷為藥食同源藥材，使用量較大，不同熏硫程度白芷在市場(chǎng)上流通售賣，藥材質(zhì)量參差不齊，不利于市場(chǎng)監(jiān)管，也限制了白芷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前針對(duì)不同熏硫程度白芷的質(zhì)量研究尚顯空白，因此本研究擬建立不同熏硫程度白芷UPLC 指紋圖譜方法，篩選出不同熏硫程度白芷差異性標(biāo)志物；并測(cè)定其3 種主要成分含量，以期為熏硫白芷質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SQP 萬分之一電子分析天平、BT125D 十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ-300 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲設(shè)備有限公司）；SHZ-D （Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 歐前胡素 （批號(hào)MUST-20031810）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)MUST-20053001）、水合氧化前胡素（批號(hào)MUST-20101314）、異歐前胡素 （批號(hào)MUST-20032420）、珊瑚菜素 （批號(hào)MUST-21060301） 對(duì)照品均購于成都曼思特生物科技有限公司；白當(dāng)歸素（批號(hào)AF9021403）、氧化前胡素（批號(hào)AF9021403） 購于成都埃法生物科技有限公司，所有對(duì)照品純度均大于98%。乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；冰乙酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；其余試劑為分析純；水為超純水。

定點(diǎn)收集33 批四川遂寧不同熏硫程度的白芷藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為杭白芷Angelicadahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.） Shan et Yuan 的干燥根，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab．1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 月旭Xtimate UHPLC C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%乙酸（B），洗脫程序見表2；體積流量0.35 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm；進(jìn)樣量3 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab．2 Procedures for gradient elution

2.2 供試品溶液制備 取白芷粉末（過4 號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，50 kHz）1 h，靜置放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取白當(dāng)歸素、氧化前胡素、異歐前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、佛手柑內(nèi)酯、水合氧化前胡素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為81.0、75.0、80.0、87.0、80.0、75.0、93.0 μg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以歐前胡素（9 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以歐前胡素（9 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值均小于1%，相對(duì)峰面積RSD 值均小于2%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以歐前胡素（9 號(hào)峰） 為參照峰，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD 值均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 UPLC 指紋圖譜的建立 將33 批白芷按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。原始數(shù)據(jù)以txt 文件格式導(dǎo)出后，導(dǎo)入Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。色譜圖見圖1。供試品色譜圖與對(duì)照品色譜峰進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出7 種成分，分別為水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素，見圖2。

圖1 不同熏硫程度白芷藥材UPLC 指紋圖譜Fig．1 UPLC fingerprints for differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig．2 UPLC chromatogran of various constituents

2.6 相似度評(píng)價(jià) 將33 批白芷樣品色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) （2012版） 》，以S6 為參照，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。不同熏硫程度白芷樣品色譜圖與參照?qǐng)D譜的相似度為0.735～0.997。結(jié)果顯示，無硫和低硫白芷相似度均高于0.950；中硫白芷除S32 外，相似度均低于0.950；高硫白芷除S33 外，相似度均低于0.900。表明不同熏硫程度白芷質(zhì)量差異較大，通過相似度評(píng)價(jià)可以進(jìn)行初步區(qū)分。

表3 不同熏硫程度白芷指紋圖譜相似度結(jié)果Tab．3 Results for fingerprint similarity of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.7 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件，以11 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以歐式距離為樣品距離進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖3。在度量距離為25 時(shí)，白芷樣品整體分為2 類；當(dāng)度量距離為17 時(shí)，白芷樣品被分為3 類，S1～S13 無硫和低硫白芷聚為Ⅰ類，S14～S18 中硫白芷聚為Ⅱ類，S19～S33 聚為Ⅲ類。結(jié)果表明，聚類分析有分類趨勢(shì)，同一熏硫程度的白芷大多被聚為一類，但也存在部分樣品分類不準(zhǔn)確的現(xiàn)象，因此需要引入有監(jiān)督的模式識(shí)別。

圖3 不同熏硫程度白芷藥材聚類分析樹狀圖Fig．3 Dendrogram of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.8 主成分分析 將33 批白芷共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 26.0 軟件，以共有峰峰面積為變量進(jìn)行主成分分析。提取標(biāo)準(zhǔn)為特征值大于1，結(jié)果見表4。共提取3 種主成分，方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.403%，表明這11 個(gè)共有峰可代表白芷指紋圖譜的大部分信息。

表4 主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab．4 PCA eigenvalues and variance contribution rate

主成分載荷矩陣反應(yīng)了各峰對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小；其絕對(duì)值越大，表明該峰對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越高，主成分因子載荷矩陣結(jié)果可見表5。由表5 可知，峰9 （歐前胡素）、峰6 （佛手柑內(nèi)酯）、峰10（珊瑚菜素） 對(duì)第一主成分有較大的貢獻(xiàn)值。

表5 主成分因子載荷矩陣Tab．5 Principal component load

采用SIMCA 14.1 軟件，對(duì)33 批白芷樣品進(jìn)行主成分分析，提取了4 種主成分建立PCA 模型，結(jié)果見圖4。模型解釋參數(shù)R2X為0.919，表示提取的主成分可解釋91.9% 的原始變量，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2為0.709。樣品總體可分為4 類，與聚類分析結(jié)果不一致，在聚類分析的基礎(chǔ)上可將無硫白芷區(qū)分開來；表明不同熏硫程度白芷化學(xué)成分含量存在一定差異，且該模型預(yù)測(cè)性良好，可以實(shí)現(xiàn)不同熏硫程度白芷的區(qū)分。

圖4 不同熏硫程度白芷的PCA 散點(diǎn)圖Fig．4 PCA score plot of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 為進(jìn)一步尋找引起不同熏硫程度白芷差異的標(biāo)志物，將共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SMICA 14.1 軟件，建立模型，OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖見圖5。白芷模型解釋率參數(shù)R2X為0.840，R2Y為0.788，預(yù)測(cè)參數(shù)Q2為0.806，均大于0.5 且接近1，表明建立的模型穩(wěn)定可靠。

圖5 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig．5 OPLS-DA analysis results of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

為防止模型過度擬合造成假陽性結(jié)果，采用置換檢驗(yàn)（n＝200） 對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，置換檢驗(yàn)圖見圖6。結(jié)果顯示，白芷檢驗(yàn)參數(shù)R2＝（0.0，0.056），Q2＝（0.0，-0.34），R2均小于0.40，Q2均小于0.05，表明所建模型擬合良好。

圖6 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 置換檢驗(yàn)圖Fig．6 OPLS-DA permutation test of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

OPLS-DA 模型中變量重要性投影值（VIP 值）可直觀反映出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物；VIP值越大，表明其對(duì)組間差異的影響權(quán)重越大。以VIP 值大于1 為閾值，篩選出5 個(gè)共有峰，見圖7，分別為峰1、峰8、峰7 （氧化前胡素）、峰5、峰3 （水合氧化前胡素）；表明這些化合物可能是影響不同熏硫程度白芷質(zhì)量差異的標(biāo)志物。

圖7 11 個(gè)共有峰VIP 值Fig．7 VIP values of eleven common peaks

2.10 主成分含量測(cè)定

2.10.1 線性關(guān)系考察 精密稱取歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為184、86、86 μg／mL 的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液1、3、6、12、15、18 μL，在“2.1” 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表6，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表6 各成分線性關(guān)系Tab．6 Linear relationships of various constituents

2.10.2 精密度試驗(yàn) 取“2.10.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.26%、0.91%、0.76%，表明該儀器精密度良好。

2.10.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取白芷粉末（S6） 6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.54%、0.66%、0.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、18、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.15%、0.15%、0.92%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的白芷粉末（S6） 0.5 g，精密稱定，按對(duì)照品與樣品1 ∶1 的比例，加入歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對(duì)照品，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素平均加樣回收率為100.93%、98.36%、96.78%，RSD 分別為2.72%、1.85%、2.32%，見表7。

表7 各成分加樣回收率結(jié)果（n＝6）Tab．7 Results of recovery rates for various constituents（n＝6）

2.10.6 含量測(cè)定 取33 批白芷，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表8。

表8 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab．8 Results of content determination for various constituents （mg／g，n＝3）

3 討論

目前，白芷HPLC 指紋圖譜或一測(cè)多評(píng)研究較多［13-14］，但采用超高效液相色譜的研究較少。因此，選擇超高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行研究，一方面是為填補(bǔ)空白，其次是為縮短進(jìn)樣時(shí)間提高檢測(cè)效率。本研究建立了不同熏硫程度白芷UPLC 指紋圖譜方法，標(biāo)定了峰面積較高的11 個(gè)共有峰，指認(rèn)了7 個(gè)共有峰，在已有的基礎(chǔ)上豐富了不同熏硫程度白芷的共有成分［15-17］；同時(shí)，通過OPLS-DA 分析篩選出5 種差異性成分，并用對(duì)照品比對(duì)出氧化前胡素、水合氧化前胡素可作為不同熏硫程度白芷的質(zhì)量差異物。2020 年版《中國藥典》 “白芷”含量測(cè)定僅以歐前胡素為指標(biāo)較為單一，建議后續(xù)可以增加其他共有成分或差異性成分作為測(cè)試指標(biāo)，以利于更加科學(xué)的評(píng)價(jià)白芷質(zhì)量。已有文獻(xiàn)報(bào)道白芷熏硫后損失最大的是氧化前胡素，其次為水合氧化前胡素［18］，與本研究結(jié)果一致，能評(píng)價(jià)不同熏硫程度白芷的整體質(zhì)量。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，33 批白芷藥材的3 種主要成分（歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素） 的含量在0.864～4.791 mg／g 之間。其中，無硫白芷的這3 種成分總含量最高，而高硫白芷的總含量最低；這可能是熏硫過程中硫磺使用量過大、熏硫時(shí)間過長(zhǎng)所導(dǎo)致的有效成分含量降低。中藥成分復(fù)雜，不同加工方式將會(huì)影響藥材質(zhì)量，因此通過多指標(biāo)的含量測(cè)定來評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量是十分有必要的。

2020 年版《中國藥典》 中除對(duì)山藥、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白術(shù)、白芍、黨參、粉葛共10 味藥材及其飲片“二氧化硫殘留量” 檢查限度標(biāo)準(zhǔn)為400 mg／kg 外；其余中藥材及飲片二氧化硫殘留量不得超過150 mg／kg。彭月［19］對(duì)市購的山藥、葛根、黃芪、黨參等88 批藥材的二氧化硫殘留量進(jìn)行測(cè)定，與限度標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，僅約四分之一的樣品符合限量要求。硫磺熏蒸最初用以防腐防蟲達(dá)到利于貯藏的目的，現(xiàn)在部分不良商家濫用硫磺熏蒸用于藥材漂白，嚴(yán)重影響藥材用藥安全［20］。本研究以白芷為例，運(yùn)用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的方法對(duì)不同熏硫程度白芷樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，也為其他熏硫藥材的評(píng)價(jià)提供參考。