謝翔雨，盧 琴，甘劍峰，盧淑婷，熊 維，楊惠霏，何國棟，黃育生，唐洪梅

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心，廣東 廣州 510405；5.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D） 臨床表現(xiàn)為腹痛腹瀉伴隨情緒失調(diào)，病情遷延難愈，我國患病率約10%，在醫(yī)學(xué)生、護(hù)士等人群中患病率甚至高達(dá)30%［1-2］，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。IBS-D 病因復(fù)雜，通常認(rèn)為它與情志失調(diào)、腸道菌群改變、腸道通透性提高、腸道低度免疫激活［1，3］等相關(guān)。

健脾祛濕膏是由四君子湯、四逆散、葛根芩連湯等經(jīng)典名方加減化裁而來的經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾祛濕、疏肝解郁之效。該膏方療效確切，是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床上常用于治療肝郁脾虛泄瀉的經(jīng)驗(yàn)方。課題組前期研究表明，健脾祛濕膏能夠改善脾虛腹瀉模型大鼠的脾虛狀態(tài)，降低結(jié)腸炎癥水平［4-5］。本研究通過復(fù)制肝郁脾虛型IBS-D 大鼠模型，觀察健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠的作用，及其對(duì)5-HT 受體、緊密連接蛋白表達(dá)和cGAS-STING通路的影響，探討其可能的作用機(jī)制，以期為健脾祛濕膏臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵） 2018-0034］，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物房［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （粵） 2018-0092］，實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過（倫理號(hào)TCMF1-2021042）。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度55%～68%，晝夜節(jié)律12 h／12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 藥物與試劑 健脾祛濕膏（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號(hào)20210707），加適量蒸餾水于研缽中研勻，配成237 g／L 的溶液；匹維溴銨（法國Abbott Healthcare SAS 公司，批號(hào)714641）；補(bǔ)脾益腸丸 （華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)2109004H）。冰醋酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，貨號(hào)DJDM000091）；舒泰［法國維克公司，進(jìn)口獸藥注冊(cè)證號(hào)（2015） 外獸藥證字43 號(hào)］；大鼠β干擾素ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)MM-61514R1）；RIPA 裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BSA 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、二抗羊抗兔／羊抗鼠（北京蘭杰柯科技有限公司，貨號(hào)BL504A、BL507A、BL521A、BL535A、BL506A、BL536A、BL003A／BL001A）；STING、p-TBK1 抗體［艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司，貨號(hào)TD12090、T58364S］；Claudin-1、TBK1 抗體（美國Proteintech 公司，貨號(hào)28674-1-AP、67211-1-Ig）；ZO-1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)PB9234）；β-tubulin、GAPDH抗體 （美國 Affinity 公司，貨號(hào) AF7011、AF7021）；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)marker、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0068、P0018S）；RNA 提取試劑 （TRIzol）、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green q-PCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，貨號(hào)AG21102、AG11706、AG11701）。

1.3 儀器 Multiskan GO 型全波長酶標(biāo)儀、QuantStudioTM5 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、Veriti 型梯度PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統(tǒng)、165-8001 型垂直板電泳槽 （美國Bio-Rad 公司）；GeneSpeed冷凍離心機(jī) （香港基因有限公司）；Pannoramic MIDI 型數(shù)字病理切片掃描儀（匈牙利3Dhistech 公司）；TS-2 型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AL1240 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 IBS-D 模型復(fù)制 參照課題組前期研究［6-7］復(fù)制IBS-D 模型大鼠，第1～14 天，將SD 大鼠乳鼠每日上午9 時(shí)與母鼠分離3 h。第15～28 天，將乳鼠倒置，把潤滑后的直腸給藥管伸入乳鼠肛門4 cm處，以0.087 mol／L 醋酸0.2 mL 灌腸，每隔1 d 增加0.1 mL，直至灌腸體積為0.5 mL 后保持不變。灌腸后隨即用醫(yī)用膠帶束縛大鼠上肢，每天束縛2 h。第29 天后停止醋酸刺激2 周，但仍每天束縛大鼠2 h，直至第43 天。

2.2 分組與給藥 第43 天（大鼠6 周齡時(shí)），將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)脾益腸丸組（1.89 g／kg）、匹維溴銨組（15.8 mg／kg） 和健脾祛濕膏低、高劑量組（2.1、4.2 g／kg，分別相當(dāng)于臨床等效劑量1、2 倍），連同實(shí)驗(yàn)最初隨機(jī)抽取的空白組（灌腸時(shí)以等量生理鹽水代替，但不進(jìn)行母嬰分離和束縛操作） 一共6 組，每組8只，雌雄各半，按照10 mL／kg 給藥量進(jìn)行灌胃，共給藥14 d （空白組給予蒸餾水）。

2.3 動(dòng)物行為學(xué)考察

2.3.1 糞便含水量測定 參照文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道方法，末次給藥2 h 后，用5 mL EP 管收集每只大鼠糞便，稱定質(zhì)量，即為濕重；置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，稱定質(zhì)量，即為干重，計(jì)算糞便含水率，公式為糞便含水率＝［（糞便濕重-糞便干重）／糞便濕重］ ×100%。

2.3.2 大鼠腸道疼痛閾值測定 將大鼠置于自制的玻璃容器內(nèi)，將6F 導(dǎo)尿管一端用潤滑油擦拭后，插入大鼠肛門約6 cm 處，用醫(yī)用膠帶將導(dǎo)尿管與大鼠尾巴根部固定，另一端與充滿水的1 mL 注射器相連接。待大鼠情緒穩(wěn)定后，緩慢推動(dòng)注射器，當(dāng)大鼠腹部肌肉強(qiáng)烈收縮并抬離桌面時(shí)，停止推動(dòng)，并記錄此時(shí)的注水量。

2.3.3 糖水偏好值測定 參照文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道方法，在給藥的第12～14 天，于前1 天晚上將大鼠禁食禁水12 h，第2 天早上9 時(shí)給予每籠大鼠已稱重的1%蔗糖水和蒸餾水各1 瓶，1 h 后取下再次稱重，計(jì)算糖水偏好值，公式為糖水偏好值＝［消耗的糖水重／（消耗的糖水+消耗的蒸餾水）］ ×100%。

2.4 樣本收集 給藥結(jié)束后，使用20 mg／mL 舒泰（0.3 mL／kg） 麻醉大鼠，隨后頸椎脫臼處死。收集各組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸，剪取約1 cm 結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛溶液中常溫放置，其余結(jié)腸組織裝于冷凍管中，于-80 ℃冰箱中保存；另取脾臟，稱重，計(jì)算脾臟系數(shù)，公式為脾臟系數(shù)＝（脾臟質(zhì)量／大鼠質(zhì)量） ×100%。

2.5 HE 染色觀察結(jié)腸組織病理形態(tài) 取于4%多聚甲醛溶液中固定的結(jié)腸組織，PBS 沖洗，依次在濃度梯度的乙醇中脫水，二甲苯透明，于石蠟中包埋，切片，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅 （HE） 染色，脫水后用中性樹膠封片，在切片掃描儀下進(jìn)行掃描和觀察。

2.6 ELISA 法檢測結(jié)腸組織IFN-β 水平 取結(jié)腸組織50 mg，加入預(yù)冷的PBS 450 μL，于冰上剪碎后勻漿，4 ℃、12 000 r／min 離心20 min，取上清液，按照BCA 試劑盒說明書測定結(jié)腸組織蛋白濃度，再按照ELISA 試劑盒說明書檢測結(jié)腸組織IFN-β 水平。

2.7 RT-qPCR 法檢測結(jié)腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-α、Claudin-1、ZO-1、cGAS、STINGmRNA 表達(dá) 取結(jié)腸組織100 mg，加TRIzol 1 mL，剪碎后勻漿，以TRIzol 法提取總RNA，測定RNA 濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)將cDNA 加DEPC 水稀釋20 倍后備用，反應(yīng)體系為10 μL （SYBR Green 5 μL，正向引物、反向引物、ROX 各0.2 μL，稀釋后的cDNA 4.4 μL），按照說明書設(shè)定程序進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。所有引物通過NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)，由廣州昂科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab．1 Primer sequences

2.8 Western blot 法檢測結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1、cGAS-STING 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取結(jié)腸組織100 mg，加入RIPA 裂解液（含PMSF） 200 μL，剪碎后勻漿，后將裂解液補(bǔ)足至1 mL，于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，取上清液，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度，取部分上清液加入Loading Buffer 配成3 μg／μL 的蛋白樣品，于-20 ℃保存，其余上清液于-80 ℃保存。每孔上樣10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，冰浴條件下濕轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF 膜上，TBST 洗膜后使用BSA 封閉液室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1 （1 ∶1 000）、ZO-1 （1 ∶1 000）、p-TBK1（1 ∶1 000）、TBK1 （1 ∶1 000）、STING （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶3 000） 一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜，室溫孵育二抗（1 ∶4 000） 1 h，滴加化學(xué)發(fā)光顯影液，于凝膠成像系統(tǒng)下顯影，使用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 24 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況觀察 空白組大鼠毛色潔白光澤，肛周干凈，四肢及尾部溫?zé)?，體質(zhì)量增長迅速，精神狀態(tài)良好；模型組皮毛光澤暗淡，大便不成型，肛周污穢，四肢及尾部體溫較低，體質(zhì)量增長緩慢，平時(shí)靜臥少動(dòng)，喜好扎堆，刺激后煩躁不安，相互撕咬，提示模型復(fù)制成功；給藥結(jié)束后，各給藥組毛色潔白有光澤，大便成型，肛周干凈，提示各給藥組可改善IBS-D 模型大鼠的一般狀況。

3.2 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠體質(zhì)量的影響 如圖1 所示，與空白組比較，模型組和各給藥組雄性大鼠體質(zhì)量均降低（P＜0.01），模型組和補(bǔ)脾益腸丸組雌性大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有上升趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n＝8）Fig．1 Effects of Jianpi Qushi Paste on the weight of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.3 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠糞便含水率、脾臟系數(shù)、腸道疼痛閾值、糖水偏好值的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠糞便含水率、脾臟系數(shù)升高（P＜0.01），疼痛閾值、糖水偏好值降低（P＜0.01），提示模型復(fù)制成功。與模型組比較，各給藥組大鼠大鼠糞便含水率降低（P＜0.05，P＜0.01），疼痛閾值升高（P＜0.05，P＜0.01），內(nèi)臟敏感得到改善；補(bǔ)脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組脾臟系數(shù)降低（P＜0.05）；補(bǔ)脾益腸丸組和健脾祛濕膏低劑量組糖水偏好值升高（P＜0.05）。

表2 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 模型大鼠糞便含水率、腸道疼痛閾值、脾臟指數(shù)、糖水偏好值的影響（±s，n＝6～8）Tab．2 Effects of Jianpi Qushi Paste on fecal water content，intestinal pain threshold，spleen index level and preference value of sugar water in IBS-D model rats （±s，n＝6-8）

表2 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 模型大鼠糞便含水率、腸道疼痛閾值、脾臟指數(shù)、糖水偏好值的影響（±s，n＝6～8）Tab．2 Effects of Jianpi Qushi Paste on fecal water content，intestinal pain threshold，spleen index level and preference value of sugar water in IBS-D model rats （±s，n＝6-8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別糞便含水率／%腸道疼痛閾值／mL脾臟系數(shù)／%糖水偏好值／%空白組57.488±4.8450.763±0.0740.226±0.02285.523±2.705模型組69.194±4.367**0.375±0.071**0.365±0.053**66.277±6.509**補(bǔ)脾益腸丸組56.513±3.266＃＃0.663±0.106＃＃0.290±0.030＃83.617±4.512＃＃匹維溴銨組61.410±4.083＃0.600±0.076＃＃0.326±0.06164.673±11.347健脾祛濕膏低劑量組57.988±2.378＃＃0.613±0.099＃＃0.276±0.034＃79.452±3.912＃健脾祛濕膏高劑量組63.251±3.495＃0.550±0.093＃0.293±0.042＃73.428±5.243

3.4 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響 如圖2 所示，各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞排列齊整，黏膜完整，腺體結(jié)構(gòu)正常，未見明顯腸道水腫、腸黏膜損壞、炎癥細(xì)胞因子浸潤的情況，均不存在器質(zhì)性病變，符合IBS 模型病理學(xué)表現(xiàn)。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE 染色（×50）Fig．2 HE staining of rat colon tissue for each group（×50）

3.5 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織IFN-β 水平的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IFN-β 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織IFN-β 水平均降低（P＜0.01）。

圖3 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織IFN-β 水平的影響（±s，n＝8）Fig．3 Effects of Jianpi Qushi Paste on IFN-β level in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.6 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-αmRNA 表達(dá)的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-αmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織5-HT2A、TNF-αmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），補(bǔ)脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組大鼠結(jié)腸組織5-HT1AmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.01）。

圖4 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig．4 Effects of Jianpi Qushi Paste on 5-HT1A，5-HT2A and TNF-α mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.7 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 如圖5～6 所示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 和Claudin-1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01），補(bǔ)脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組大鼠結(jié)腸組織ZO-1 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig．5 Effects of Jianpi Qushi Paste on Claudin-1 and ZO-1 mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝6）

圖6 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織Claudin-1、ZO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig．6 Effects of Jianpi Qushi Paste on Claudin-1 and ZO-1 protein expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝3）

3.8 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織cGASSTING 信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 如圖7～8 所示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織cGAS、STINGmRNA 和STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織cGAS、STINGmRNA 和STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖7 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織cGAS、STING mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig．7 Effects of Jianpi Qushi Paste on cGAS and STING mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

圖8 健脾祛濕膏對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝4）Fig．8 Effects of Jianpi Qushi Paste on protein expressions of STING，TBK1 and p-TBK1 in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝4）

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為IBS-D 屬于“泄瀉” “腹痛” 范疇，肝郁脾虛被認(rèn)為是IBS-D 的基本病機(jī)［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健脾祛濕膏能夠增加IBS-D 大鼠體質(zhì)量，減輕腹瀉程度，使脾臟系數(shù)恢復(fù)至正常水平，并改善行為學(xué)表現(xiàn)，提示健脾祛濕膏能夠改善IBSD 大鼠腹瀉和脾虛肝郁的狀態(tài)。

5-HT 屬于腦腸肽的一種，胃腸道是體內(nèi)5-HT最豐富的來源，它對(duì)腸道運(yùn)動(dòng)、腸道分泌和內(nèi)臟敏感性有著重要的調(diào)節(jié)作用［9］。5-HT1A、5-HT2A受體拮抗劑因其在內(nèi)臟疼痛模型中具有鎮(zhèn)痛作用，被認(rèn)為是治療IBS-D 的靶點(diǎn)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠5-HT1A、5-HT2AmRNA 表達(dá)均高于空白組，這與先前相關(guān)報(bào)道的研究結(jié)果一致［10］；健脾祛濕膏給藥后5-HT1A、5-HT2AmRNA 表達(dá)降低，提示健脾祛濕膏治療IBS-D 可能與其解郁止痛的功效相關(guān)。

緊密連接（TJs） 是一種多蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通透性［12］。TJs 控制抗原通過腸上皮屏障的傳遞，并在維持屏障的完整性方面起著關(guān)鍵作用。TJs 蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，進(jìn)而引發(fā)腸道通透性的改變，細(xì)菌及其代謝物“滲漏” 進(jìn)入腸道內(nèi)部和全身循環(huán)，導(dǎo)致黏膜甚至全身免疫激活被放大，而免疫的激活又有可能反過來加重腸道屏障的損害程度［12］。因此腸道屏障功能的受損可能是導(dǎo)致IBS-D 患者和模型動(dòng)物糞便含水率升高和腸道低度炎癥的重要原因［12-14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Claudin-1 和ZO-1 作為緊密連接蛋白家族代表性成員，其在模型組中mRNA 和蛋白表達(dá)均降低；經(jīng)健脾祛濕膏干預(yù)后，Claudin-1 和ZO-1 表達(dá)有所上升。

IBS-D 的腸道屏障完整性受損可能導(dǎo)致微生物穿過腸道屏障進(jìn)入固有層而激活免疫應(yīng)答。有研究報(bào)道稱，IBS-D 患者體內(nèi)TNF-α 水平提高，并與腹瀉程度相關(guān)［3，15］，提示腸道內(nèi)存在炎性應(yīng)答。cGAS-STING 信號(hào)通路屬于固有免疫，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，但其過度激活會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)［16-18］。cGAS 可以識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中細(xì)菌所泄露的游離DNA，合成第二信使環(huán)鳥苷酸-腺苷酸 （cyclin GMP-AMP，cGAMP），以激活下游的STING 受體蛋白［4］。STING 作為此通路的樞紐，還能被細(xì)菌環(huán)二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs） 直接激活，促進(jìn)TBK1 募集和磷酸化，從而促使I 型干擾素（如IFN-β） 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在生理狀態(tài)下，腸道分泌一定水平的IFN-β 能使腸道及時(shí)應(yīng)對(duì)入侵的微生物，但其過度表達(dá)會(huì)加劇免疫細(xì)胞的激活，引起免疫微環(huán)境失衡［19-20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IBS-D 大鼠結(jié)腸組織cGAS-STING 通路被激活；給予健脾祛濕膏干預(yù)后，cGAS-STING 通路受到抑制。

綜上所述，本研究表明，健脾祛濕膏具有疏肝健脾止瀉的功效，能夠改善IBS-D 大鼠情志不調(diào)、腹瀉、內(nèi)臟高敏感，上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-1、ZO-1 表達(dá)。同時(shí)，本研究表明IBS-D 大鼠結(jié)腸組織cGAS-STING 通路被激活，促炎因子IFN-β 釋放增加，健脾祛濕膏干預(yù)可抑制cGAS-STING 通路活化。