陳洪民，潘艷伶，伏紅穎，楊 紅，凌湘力

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

糖尿病腎病不僅是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是終末期腎臟病的主要原因［1-2］。腎臟纖維化是糖尿病腎病最主要的病理特征，表現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 在腎小球基底膜和腎小管間質(zhì)中異常沉積［3］。腎臟功能的損傷與腎臟纖維化密切相關(guān)，對(duì)抗腎臟纖維化是減輕糖尿病腎病的內(nèi)在機(jī)制。但目前臨床上尚無(wú)治療腎臟纖維化的特效藥物［4-5］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1） 被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，介導(dǎo)多種信號(hào)參與腎臟纖維化的過(guò)程［6］。研究表明，microRNA-21 （miRNA-21） 亦與腎臟的纖維化相關(guān)，miRNA-21 基因缺失能夠抑制糖尿病腎病小鼠的腎臟纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1及相關(guān)基質(zhì)蛋白有關(guān)［7］。

“糖通飲” 是全國(guó)名中醫(yī)凌湘力教授臨床治療糖尿病腎病所創(chuàng)建的經(jīng)驗(yàn)方。課題組在前期研究中已證實(shí)糖通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟功能具有保護(hù)作用［8-9］，但其具體機(jī)制尚未完全明確。故本研究擬通過(guò)觀察糖通飲對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟miRNA-21、TGF-β1的影響，初步探討糖通飲延緩糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化來(lái)保護(hù)腎臟的作用機(jī)制，以期為臨床防治糖尿病腎病，延緩腎臟纖維化提供新的選擇，并進(jìn)一步從分子生物學(xué)層面揭示其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（180±20） g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （遼） 2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)2000575）。

1.2 藥物 糖通飲顆粒制劑由廣東一方制藥有限公司提供，由生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、黃芪、丹參、地骨皮、草決明組成，將20.69 g 糖通飲顆粒制劑充分溶于23 mL 去離子水中，生藥質(zhì)量濃度為6 g／mL （20.69 g 糖通飲顆粒制劑即一劑糖通飲生藥劑量）。厄貝沙坦片（國(guó)藥準(zhǔn)字J20171089），由法國(guó)Sanofi 公司提供，使用去離子水制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的母液。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素（STZ，貨號(hào)V900890）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；尿蛋白定量試劑盒（貨號(hào)C035-2-1） 購(gòu)自南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)11141ES10）、PCR 熒光定量試劑盒（貨號(hào)1184ES25） 購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒 （貨號(hào)R11068.5） 購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；一抗（兔抗鼠） TGF-β1（貨號(hào)EPR21143）、Smad2（貨號(hào)EP784Y）、Smad3 （貨號(hào)EP568Y） 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Col-Ⅲ （貨號(hào)22734-1-AP）、FN（貨號(hào)15613-1-AP）、GAPDH （貨號(hào)HRP-60004）、二抗（羊抗兔） HRP 標(biāo)記lgG （貨號(hào)SA00001-2）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液（貨號(hào)H31500-1） 購(gòu)自常州天地人和生物科技有限公司；改良Masson 三色染色試劑盒（貨號(hào)G1346） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶兩步法檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)PV-9000）、二氨基聯(lián)苯胺顯色液（貨號(hào)ZLI-9018） 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 穩(wěn)豪倍易型血糖儀（美國(guó)Johnson ＆Johnson 公司）；Cobasc702 型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche 公司）；CFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Tanon-5200 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olypums 公司）。

2 方法

2.1 糖尿病腎病大鼠模型復(fù)制 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)抽取10 只為正常組，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 周；其余50 只大鼠為造模組進(jìn)行糖尿病腎病造模，給予高脂高糖飲食（常規(guī)飼料58%、精煉豬油20%、糖20%、膽固醇2%），喂養(yǎng)8 周。相應(yīng)飼料喂養(yǎng)結(jié)束后，禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射含1% STZ 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），正常組大鼠腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，注射3 次，劑量分別為20、25、30 mg／kg，每次間隔72 h。造模組大鼠于第3 次注射結(jié)束72 h 后，連續(xù)3 次（每次間隔24 h） 檢測(cè)空腹血糖，若大于16.7 mmol／L，且伴有飲水量、尿量增加，判定大鼠糖尿病模型造模成功。繼續(xù)給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)3 周，每周固定時(shí)間監(jiān)測(cè)空腹血糖，代謝籠收集24 h 尿液檢測(cè)24 h 尿蛋白定量，若24 h 尿蛋白≥30 mg，則判定大鼠糖尿病腎病模型造模成功［10］。

2.2 分組與給藥 大鼠糖尿病腎病模型造模成功后，隨機(jī)分為模型組，糖通飲低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，每組10 只。糖通飲低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予糖通飲顆粒制劑6.21、12.42、24.84 g／kg，每天1 次，連續(xù)8 周（大鼠用量按人與動(dòng)物體表面積的等效比值表折算，分別為成人用量的0.5、1、2 倍）；厄貝沙坦組大鼠灌胃給予13.5 mg／kg 厄貝沙坦片溶液，每天1 次，連續(xù)8 周（為成人等效劑量）；正常組與模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)8 周。給藥期間，各組大鼠均以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由攝水?dāng)z食。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 給藥8 周后，代謝籠收集24 h尿液并采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠尿微量白蛋白水平；禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖后，腹腔注射10% 水合氯醛3 mL／kg 麻醉，股動(dòng)脈取血，離心取血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平；迅速摘取左、右腎組織并稱(chēng)定質(zhì)量，一部分置于4%多聚甲醛中固定，其余置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.4 HE、Masson 和免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛固定的大鼠腎組織，制成4 μm 的石蠟切片，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE 和Masson 染色，觀察各組大鼠病理學(xué)形態(tài)。采用免疫組化SP 二步法，將石蠟切片脫臘、水化及微波爐抗原修復(fù)，3%H2O2孵育，加入一抗TGF-β1（1 ∶25）、FN （1 ∶50）、Col-Ⅲ（1 ∶50），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌后，二抗孵育，DAB 溶液顯色，顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達(dá) TRIzol 法提取各組大鼠腎組織總RNA，分光光度法檢測(cè)并計(jì)算其含量及濃度。由上海生工工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成 TGF-β1、FN、Col-Ⅲ引物，見(jiàn)表 1，用YEASEN 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成miRNA-21 引物，RiboBio 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟及反應(yīng)體系均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。PCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃2 s，60 ℃20 s，70 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)；70 ℃10 min。以U6 和GADPH為內(nèi)參，記錄各樣本CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)，重復(fù)3 次。

表1 引物序列Tab．1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測(cè)大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá) 取0.1 g 腎組織，加入500 μL RIPA 裂解液研磨，離心取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。加入1.5×上樣緩沖液，煮沸后，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，1×TBST洗膜3 次，加入兔抗鼠GAPDH （1 ∶7 000）、TGFβ1（1 ∶1 000）、FN （1 ∶500）、Col-Ⅲ（1 ∶500）一抗，在4 ℃下孵育過(guò)夜，次日TBST 洗膜3 次，加入山羊抗兔IgG-HRP 二抗稀釋液，室溫孵育1 h，ECL 顯影，Tanon 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，采用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)，組間比較兩兩采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖通飲對(duì)大鼠腎臟肥大指數(shù)、空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎臟肥大指數(shù)、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠腎臟肥大指數(shù)、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），厄貝沙坦組大鼠腎臟肥大指數(shù)、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟肥大指數(shù)、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平變化（±s，n＝6）Fig．1 Changes in the renal hypertrophy index，F(xiàn)BG，24 h ALB，BUN and SCr of rats in each group （±s，n＝6）

3.2 糖通飲對(duì)大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)排列完整清晰；模型組大鼠可見(jiàn)腎小球系膜增生明顯，基底膜增厚，腎小球體積增大，腎小管萎縮，管腔狹窄；糖通飲各劑量組及厄貝沙坦組大鼠的病變程度均降低，見(jiàn)圖2。與正常組比較，模型組大鼠腎小球內(nèi)及腎小管間質(zhì)藍(lán)色物質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性，膠原纖維增多（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠藍(lán)色物質(zhì)減少（P＜0.05），色淺，膠原沉積減少，見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠腎組織HE 染色（×400）Fig．2 HE staining of rat kidney tissues in each group（×400）

圖3 各組大鼠腎組織膠原沉積情況（×400，±s，n＝6）Fig．3 Collagen deposition of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.3 糖通飲對(duì)大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達(dá)的影響 正常組大鼠腎組織TGF-β1主要在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)、腎小球系膜區(qū)有少量表達(dá)，F(xiàn)N、Col-Ⅲ主要在腎小管、腎小管間質(zhì)表達(dá)，腎小球內(nèi)也有少量表達(dá)，均呈棕黃色顆粒或團(tuán)塊散在分布；與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達(dá)升高（P＜0.05），顏色深；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組與厄貝沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達(dá)降低 （P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)（×400，±s，n＝6）Fig．4 Protein expressions of TGF-β1，Col-Ⅲand FN of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.4 糖通飲對(duì)大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲低劑量組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FN mRNA 表達(dá)（±s，n＝6）Fig．5 mRNA expressions of miRNA-21，TGF-β1，Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

3.5 糖通飲對(duì)大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲低劑量組大鼠腎組織TGFβ1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05），糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05），見(jiàn)圖6～7。

圖6 各組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白條帶圖Fig．6 Bands of TGF-β1、Col-Ⅲand FN proteins of the rat kidney tissues in each group

圖7 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)（±s，n＝6）Fig．7 Protein expressions of TGF-β1、Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

4 討論

在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，沒(méi)有關(guān)于糖尿病腎病的病名記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)消渴并“虛勞” “腎勞” “水腫” 等范疇。全國(guó)名中醫(yī)凌湘力教授認(rèn)為糖尿病腎病是由糖尿病發(fā)展演變而來(lái)的一種虛實(shí)夾雜的并病，其基本病機(jī)以氣陰兩虛為本，痰瘀濁毒阻絡(luò)為標(biāo)。據(jù)此創(chuàng)建經(jīng)驗(yàn)方“糖通飲”，方中君藥黃芪及臣藥山萸肉、生地黃、山藥可補(bǔ)肝腎、調(diào)氣陰以固本；佐使藥配以地骨皮、茯苓、草決明、丹參、丹皮、澤瀉，以祛痰瘀濁毒，疏通腎絡(luò)，諸藥合用補(bǔ)泄兼施，標(biāo)本同治。臨床使用能有效控制糖尿病腎病患者血糖，降低蛋白尿，保護(hù)腎與模型組比較，＃P＜0.05。功能，延緩糖尿病腎病進(jìn)展［11-12］。

糖尿病腎病作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，腎臟纖維化是最重要的病理生理過(guò)程［13-14］。早期可見(jiàn)ECM 過(guò)度沉積、腎小球基底膜增厚，大量膠原沉積，逐漸出現(xiàn)腎小球硬化及腎臟纖維化［15］。該病理過(guò)程與糖尿病腎病嚴(yán)重程度相關(guān)，是其進(jìn)展的標(biāo)志，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過(guò)控制血糖、血壓、蛋白尿等手段改善糖尿病腎病狀態(tài)，但長(zhǎng)期預(yù)后仍不佳。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦即是臨床常用于延緩糖尿病腎病腎損傷的用藥，具有降壓、減輕尿蛋白的作用［16-17］。本研究HE、Masson染色可見(jiàn)，模型組大鼠腎組織系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，膠原纖維沉積；24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐降低；而經(jīng)各劑量糖通飲及厄貝沙坦干預(yù)后，均能不同程度減輕其腎臟病理?yè)p傷，延緩腎臟纖維化進(jìn)展，且中劑量糖通飲即能取得與厄貝沙坦相似的療效，并擁有厄貝沙坦單用所不具備的改善血糖作用。

糖尿病腎病腎臟纖維化機(jī)制復(fù)雜，多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的激活參與了其發(fā)病過(guò)程。其中TGF-β1被認(rèn)為是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化機(jī)制中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子［18］，他能通過(guò)激活其下游因子，刺激ECM 生成并抑制其降解，促進(jìn)腎臟纖維化［19］。同時(shí)miRNA-21 的表達(dá)亦與腎臟纖維化相關(guān)，miRNA-21 上調(diào)可促進(jìn)腎臟纖維化，其機(jī)制可能依賴(lài)與TGF-β1及其相關(guān)通路的協(xié)同作用［20-22］。故為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖通飲延緩腎臟纖維化的機(jī)制，本研究檢測(cè)miRNA-21、TGF-β1以及ECM 主要成分蛋白FN、Col-Ⅲ表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達(dá)升高；而經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)，除糖通飲低劑量組對(duì)以上指標(biāo)影響不顯著，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達(dá)均降低，組間差異不顯著。由此可知，糖通飲對(duì)腎臟纖維化的影響可能與下調(diào)miRNA-21、TGF-β1表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，糖通飲能夠延緩糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化，保護(hù)腎臟功能，且使用中劑量糖通飲時(shí)即可產(chǎn)生較佳效果，其機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)miRNA-21、TGF-β1的調(diào)控，減少ECM 的沉積產(chǎn)生的。