譚小青，丘海芯，高紅偉，唐紅珍，覃喜軍，劉振杰*

（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530299）

白頭翁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是毛茛科植物白頭翁Pulsatillachinensis（Bge.） Regel 的干燥根，具有清熱解毒、涼血止痢功效［1-2］，臨床上主要用于治療急性菌?。?-4］、潰瘍性結(jié)腸炎［5-6］、腫瘤［7-10］等疾病。白頭翁湯組方包括4 味中藥，分別是君藥白頭翁、臣藥黃連和黃柏、使藥秦皮［11］，皂苷、生物堿、香豆素、黃酮、檸檬苦素、甾醇、木脂素為其主要有效成分［12-13］。賈婭倩等［14］采用HPLC法對(duì)白頭翁湯中6 種指標(biāo)成分含量進(jìn)行測(cè)定，樸美憬等［15］采用HPLC 法結(jié)合紫外法測(cè)定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4 含量，時(shí)維靜等［16］采用正交試驗(yàn)對(duì)白頭翁湯提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，再采用HPLC 法測(cè)定小檗堿含量。

前期報(bào)道，白頭翁湯含量測(cè)定方法主要是HPLC 法、分光光度法，測(cè)定成分主要是生物堿、香豆素，而對(duì)君藥白頭翁活性成分白頭翁皂苷的研究較少，也尚未對(duì)該方進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS／MS 方法同時(shí)測(cè)定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿的含量，并考察其配伍前后變化，以期為該方及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Xevo TQ-XS 超高效液相色譜／三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置電噴霧離子源（ESI）、Analyst 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，購自美國Waters 公司；Genius NM32LA 氮?dú)獍l(fā)生器，購自英國 Peak Scientific 公司；SQP 電子天平（十萬分之一），購自賽多利斯科學(xué)儀器 （北京） 有限公司；Centrifuge5424R 離心機(jī)，購自德國Eppendorf 公司。

1.2 試劑與藥物 白頭翁皂苷 B4 （批號(hào)PS010748）、白頭翁皂苷B5 （批號(hào)PS010727）、黑海常春藤皂苷A1 （批號(hào)PS001149）、白頭翁皂苷D （批號(hào)PS190923-03）、白頭翁皂苷A3 （批號(hào)PS011161）、α-常春藤皂苷（批號(hào)PS000085）、秦皮甲素 （批號(hào) PS011025）、秦皮乙素 （批號(hào)PS011505）、秦皮素（批號(hào)PSOOO762）、黃柏堿（批號(hào)PS000447），鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)PS020011）、鹽酸黃連堿 （批號(hào)PS190923-04），鹽酸小檗堿（批號(hào)PS001003） 對(duì)照品均購自成都普思生物科技股份有限公司（純度≥98%）。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為飲用水，購自屈臣氏集團(tuán)（香港） 有限公司。

1.3 藥材 白頭翁、黃連、黃柏、秦皮購自全國各地，批號(hào)見表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)許瓊明教授鑒定，白頭翁為毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bge.） Regel 的干燥根，秦皮為木犀科植物白蠟樹FraxinuschinensisRoxb 的干燥枝皮［17-18］，黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch 的干燥根莖，黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron siniiY.C.Wu 的干燥樹皮［19］，按2020 年版《中國藥典》 一部標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)均合格。

表1 白頭翁湯藥材批號(hào)Tab．1 Batches of medicinal materials in Baitouweng Decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿對(duì)照品適量，甲醇溶解，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為28.2、19.8、33、23、20.8、23.4、48、41、29.2、22.4、27.8、21.4、32.2 ng／mL），保存于4 ℃冰箱中。

2.2 供試品溶液制備 取白頭翁、黃柏、黃連、秦皮適量，除去雜質(zhì)，切碎，本實(shí)驗(yàn)用藥量按《傷寒論》 處方藥量減半。

2.2.1 白頭翁 取藥材6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，濾過，繼續(xù)加8 倍量水微沸1 h，濾過，合并濾液，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，50%甲醇稀釋定容至100 mL 量瓶中，即得，同法制備4 份。

2.2.2 白頭翁湯 取白頭翁6 g、黃柏4.5 g、黃連3 g、秦皮6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，濾過，繼續(xù)加8 倍量水微沸1 h，濾過，合并濾液，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，50%甲醇稀釋定容至250 mL 量瓶中，即得，同法制備4 份。

2.2.3 缺白頭翁陰性湯 取黃柏4.5 g、黃連3 g、秦皮6 g （除去白頭翁），其他操作同 “2.2.2”項(xiàng)，即得，同法制備4 份。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC ? BEH C18色譜柱 （2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.1% 甲酸 （B），梯度洗脫 （0～0.5 min，10% A；0.5～2 min，10%～90% A；2～4 min，90%A；4～6 min，90%～10% A）；體積流量0.2 mL／min；柱溫24.5 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度550℃，體積流量1 000 L／h；錐孔氣體積流量50 L／h；正負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式，其他參數(shù)見表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab．2 Mass spectrum parameters for various constituents

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液各1份，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，2 種溶液在同一出峰時(shí)間均出現(xiàn)各成分色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC-MS／MS 圖Fig．1 HPLC-MS／MS spectra for various constituents

2.5.2 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液適量，50%甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以S／N＝3 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab．3 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“ 2.5.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.3”“2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為5.5%、6.9%、2.9%、9.6%、4.2%、4.8%、1.6%、1.1%、1.5%、0.6%、0.4%、0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白頭翁湯供試品溶液（B1） 適量，室溫下于0、6、12、18、24 h 在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為3.3%、7.1%、5.1%、2.1%、10.3%、11.2%、10.0%、7.3%、3.7%、2.1%、0.4%、1.2%、0.9%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取白頭翁湯（B1） 6 份，按“ 2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為2.8%、3.1%、1.4%、12.6%、9.2%、8.1%、5.1%、4.8%、3.6%、1.0%、3.3%、2.6%、1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的白頭翁湯（B1） 6 份，分別加入100%水平對(duì)照品溶液1 mL，按“ 2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿平均加樣回收率分別為106.2%、105.6%、99.7%、101.9%、98.3%、101.1%、103.5%、100.0%、93.9%、102.5%、98.9%、97.9%、94.4%，RSD 分別為3.1%、2.3%、1.9%、1.1%、3.3%、1.5%、2.9%、1.6%、3.8%、4.2%、3.2%、4.1%、2.6%。

2.6 樣品含量測(cè)定 取白頭翁、白頭翁湯、缺白頭翁陰性湯適量，按“ 2.2” 項(xiàng)下方法各平行制備4 份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝6）Tab．4 Results of content determination of various constituents （n＝6）

2.7 配伍前后含量變化分析 圖2 顯示，白頭翁中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5 含量均高于白頭翁湯中；單糖類皂苷α-常春藤皂苷、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷A3 含量在白頭翁中較高，以白頭翁皂苷A3 含量更明顯，而白頭翁皂苷D 含量在白頭翁湯中較高；缺白頭翁陰性湯中秦皮甲素、黃柏堿、巴馬汀等生物堿含量均高于白頭翁湯中，而白頭翁湯中秦皮素、秦皮乙素含量更高。

圖2 不同樣品中各成分含量變化Fig．2 Changes in contents of various constituents in different samples

圖3 顯示，白頭翁湯中雙糖類皂苷（白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5） 含量約為白頭翁中的1／5，單糖類皂苷（黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷） 含量約為白頭翁中的1／2，即合煎時(shí)皂苷含量低于單煎時(shí)；缺白頭翁陰性湯中香豆素（秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素） 含量約為白頭翁湯中的1／3，而白頭翁湯中生物堿（黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿）約為去頭翁湯的1／2，即單煎時(shí)香豆素含量低于合煎時(shí)，而生物堿含量更高。

圖3 不同種類成分含量變化Fig．3 Changes in contents of different kinds of constituents

3 討論

為了減少提取時(shí)氣泡的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)在提取前先將藥材浸泡30 min 后再加熱。由于流動(dòng)相為甲酸時(shí)峰形更理想，故選擇其作為流動(dòng)相。在正離子模式下，黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿、白頭翁皂苷B5 有響應(yīng)，而其他8 種成分在負(fù)離子模式下有響應(yīng)。另外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑或樣品本身含有Na+，導(dǎo)致待測(cè)成分也產(chǎn)生了相關(guān)離子峰，通過儀器調(diào)諧功能進(jìn)行正負(fù)離子調(diào)諧，發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷B5 正離子有很好的響應(yīng)值，故選擇該模式作為其檢測(cè)方式。

前期報(bào)道，處方中藥材單煎、合煎可能改變其成分種類和含量［20-23］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS／MS法分別對(duì)白頭翁、白頭翁湯、缺白頭翁陰性湯中各成分含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)合煎會(huì)導(dǎo)致皂苷、生物堿類成分溶出量降低，香豆素類成分溶出量升高，推測(cè)可能是因?yàn)榍? 類成分結(jié)合生成其他化合物而導(dǎo)致其溶出減少，而白頭翁湯中其他藥材可增加后一類成分溶出。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿的含量，并考察配伍前后其變化，該方法簡便可行，試劑消耗少，檢測(cè)時(shí)間短，對(duì)該方質(zhì)量控制有一定參考價(jià)值。