吳淑珍，王 成，桂雙英，彭 燦，羅建平，李強明*

（1.合肥工業(yè)大學，安徽 合肥 240603；2.霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，安徽 六安 237200；3.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012）

靈芝作為傳統(tǒng)名貴中藥，具有補氣安神、止咳平喘、延年益壽等功效［1-3］，靈芝三萜是其主要活性成分之一，有著護肝、抗病毒、抗腫瘤等活性，開發(fā)前景廣泛［4-5］，目前其提取方法主要有熱回流提?。?］、超聲提取［7］、超臨界提?。?］、酶提取［9］等，但存在溫度高、時間長、操作繁瑣、成本高昂等缺點。真空耦合超聲提取是在真空條件下對中藥活性成分進行超聲提取的方法，其中真空通過降低溶劑沸點來實現(xiàn)低溫高效提取，而超聲通過空化效應來加速活性成分溶出［10］，其省時、省力、高效，但尚未應用于靈芝三萜的提取。因此，本實驗優(yōu)化靈芝三萜真空耦合超聲提取工藝。

帕金森病是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡為病理特征，靜止性震顫、運動遲緩、肌強直等為臨床表現(xiàn)的第二大神經(jīng)退行性疾病，目前臨床上仍主要以左旋多巴等藥物進行對癥治療，但不能挽救多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，故發(fā)掘相關(guān)中藥活性成分具有重要意義［11］。根據(jù)靈芝傳統(tǒng)功效，課題組前期推測靈芝三萜可能具有抗帕金森病活性，但未見相關(guān)報道，故本實驗通過建立小鼠帕金森病模型來對此進行研究。

1 材料

1.1 試劑與藥物 齊墩果酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，純度≥98%）。乙醇、左旋多巴、冰醋酸、氯化鈉、CMC-Na、蒸餾水、高氯酸、水合氯醛、多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器 AL104 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；V-5000 可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）；KW-6C 疲勞轉(zhuǎn)棒儀（南京卡爾文生物科技有限公司）。

1.3 藥材 靈芝子實體購自霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，經(jīng)合肥工業(yè)大學羅建平教授鑒定為正品。

1.4 動物 SPF 級C57BL／6 雄性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK （豫）2020-0005。

2 方法

2.1 靈芝三萜含量、得率測定

2.1.1 線性關(guān)系考察 參考文獻［9］ 報道，以齊墩果酸為對照品，在546 nm 波長處測定吸光度，以其為縱坐標（A），質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，得方程為A＝58.225X-0.047 3 （R2＝0.995 0）。

2.1.2 測定方法 精密量取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL 離心管中，按“2.1.1” 項下方法測定吸光度，計算含量。再測定該成分得率，公式為得率＝（CV／M） ×100%，其中C為供試品溶液質(zhì)量濃度，V為濾液體積，M為靈芝子實體粉末質(zhì)量。

2.2 單因素試驗 將靈芝子實體粉碎10 min 后過200 目篩，得到超微粉，置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，精密稱取1 g 至具塞錐形瓶中，加入90%乙醇30 mL，設定超聲功率為240 W，開啟真空泵形成負壓，通過二通閥調(diào)節(jié)真空度為0.08 MPa，在30 ℃下超聲提取，分別考察不同超聲時間（5、10、20、40、80 min）、超聲溫度 （20、30、40、50、60 ℃）、乙醇體積分數(shù) （70%、80%、90%、95%、100%）、料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶ 50）、超聲功率 （150、180、240、270、300 W） 對靈芝三萜得率的影響。

2.3 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇提取時間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、料液比 （D） 進行四因素三水平設計，具體見表1。

表1 因素水平Tab．1 Factors and levels

2.4 抗帕金森病活性研究

2.4.1 靈芝三萜制備 將優(yōu)化工藝所得的靈芝三萜按照文獻［12］ 報道進行純化，先用氯仿萃取濃縮，再用相同體積的飽和NaHCO3溶液提取4次，鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3～4，將沉淀溶于氯仿中減壓干燥，測得得率為0.38%。

2.4.2 分組、造模及給藥 參考文獻［13］ 報道，50 只小鼠隨機均分為正常組、模型組、陽性藥組（L-多巴胺，75 mg／kg）、靈芝三萜高劑量組（200 mg／kg）、靈芝三萜低劑量組（100 mg／kg），陽性藥組、靈芝三萜各劑量組小鼠均連續(xù)灌胃給藥14 d。從給藥第4 天開始，模型組、陽性藥組、靈芝三萜各劑量組小鼠均腹腔注射MPTP（30 mg／kg），連續(xù)7 d，正常組小鼠灌胃給予生理鹽水。

2.4.3 行為學測試

2.4.3.1 轉(zhuǎn)棒實驗 將小鼠依次放置在轉(zhuǎn)棒儀上，設定轉(zhuǎn)速為40 r／min，記錄從登棒到掉棒的時間，從造模前3 d 開始訓練，每天1 次。末次給藥后，每只小鼠進行3 次測試，取平均值。

2.4.3.2 懸掛實驗 將小鼠前爪掛在直徑5 mm的玻璃棒上（為了防止其趴在玻璃棒上，用透明塑料板將頂部蓋?。?，記錄抓住玻璃棒的時間，從造模前3 d 開始懸掛訓練，每天3 次。末次給藥后，每只小鼠進行3 次測試，取平均值。

2.4.4 腦組織指標檢測

2.4.4.1 黑質(zhì)致密部Nissl 染色 處死小鼠，取腦組織黑質(zhì)致密部，石蠟包埋后進行切片，按照Nissl 試劑盒操作步驟進行染色，最后封片并進行拍照。

2.4.4.2 黑質(zhì)致密部、紋狀體酪氨酸羥化酶（TH） 免疫組織化學 處死小鼠，取腦組織黑質(zhì)致密部、紋狀體部位，石蠟包埋后進行切片，按照免疫組織化學步驟進行操作，統(tǒng)計TH 免疫反應陽性神經(jīng)元情況［14］。

2.5 圖像分析 參考文獻［14-16］ 報道，采用Image-pro Plus 軟件統(tǒng)計小鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量。

2.6 數(shù)據(jù)分析 通過GraphPad Prism 軟件進行數(shù)據(jù)處理，one-way ANOVN 單因素方差分析、多重比較分析進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以（±s） 表示。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗

3.1.1 超聲時間 圖1 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲提取時間延長先升高，可能是由于超聲波空化效應破壞了細胞壁，促使該成分溶出，在40 min時最高；40 min 后其得率反而降低，可能與不斷超聲會破壞結(jié)構(gòu)成分有關(guān)［17］。

圖1 超聲時間對靈芝三萜得率的影響Fig．1 Effect of ultrasonic time on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.2 超聲溫度 圖2 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲溫度增加先升高，表明高溫會加快分子運動速度，促進該成分浸出，在50 ℃時最高；50 ℃后其得率反而降低，可能與溫度過高會破壞結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。

圖2 超聲溫度對靈芝三萜得率的影響Fig．2 Effect of ultrasonic temperature on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.3 乙醇體積分數(shù) 圖3 顯示，靈芝三萜得率隨著乙醇體積分數(shù)增加先升高，在90% 時最高；之后其得率反而降低，可能與醇類成分溶出增加會導致三萜類成分溶出減少有關(guān)［18］。

圖3 乙醇體積分數(shù)對靈芝三萜得率的影響Fig．3 Effect of ethanol concentration on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.4 料液比 圖4 顯示，靈芝三萜得率隨著料液比增加先升高后趨于平穩(wěn)，在1 ∶20 時最高，可能是因為其傳質(zhì)過程有所加快［19］。

圖4 料液比對靈芝三萜得率的影響Fig．4 Effect of solid-liquid ratio on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.5 超聲功率 圖5 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲功率增加先升高，在240 W 時最高；240 W 后其得率反而降低，可能與溶液分子運動加劇有關(guān)［20］。

圖5 超聲功率對靈芝三萜得率的影響Fig．5 Effect of ultrasonic power on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以靈芝三萜得率為評價指標，采用L9（34） 表進行設計，結(jié)果見表2。由此可知，提取時間影響程度最大，料液比影響程度最小；最優(yōu)工藝為A3B3C3D2，即超聲時間60 min，超聲溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)95%，料液比1 ∶20。

表2 試驗設計與結(jié)果Tab．2 Design and results of tests

3.3 驗證試驗、對比試驗 對“3.2” 項下工藝進行5 批驗證試驗，測得靈芝三萜平均得率為0.887%，大于表2 最大值，表明該工藝穩(wěn)定可靠。再參照文獻 ［21］ 報道進行提取，即超聲時間40 min，超聲溫度30 ℃，乙醇體積分數(shù)90%，料液比1 ∶30，測得靈芝三萜平均得率為0.551%，而驗證試驗結(jié)果與其相比提高了60.98%，進一步印證了真空耦合超聲提取的優(yōu)越性。

3.4 行為學檢測 如圖6A 所示，與模型組比較，靈芝三萜各劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時間延長（P＜0.05）。如圖6 所示，與模型組比較，靈芝三萜各劑量組小鼠懸掛時間延長（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 小鼠行為學檢測結(jié)果Fig．6 Results of mouse behavioral detection

3.5 腦組織檢測 如圖7A 所示，模型組小鼠黑質(zhì)致密部Nissl 陽性細胞數(shù)少于正常組（P＜0.05），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。如圖7B 所示，模型組小鼠黑質(zhì)致密部TH 陽性細胞數(shù)少于正常組（P＜0.01），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.01）。如圖7C 所示，模型組小鼠紋狀體TH 陽性纖維數(shù)少于正常組（P＜0.01），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.01）。

圖7 小鼠腦組織檢測結(jié)果Fig．7 Results of mouse brain tissue detection

4 討論與結(jié)論

前期報道，李顏桃等［10］采用真空耦合超聲提取沙棘籽多酚，操作簡便，得率較高；田莉等［22］通過該方法提取蘋果渣多酚，時間縮短，得率提高。本實驗發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜以該方法提取后得率較前期方法增加60.98%，進一步印證了其優(yōu)越性。

研究表明，靈芝三萜具有多種生物活性，Yu等［23］證明它可改善小鼠認知障礙，減輕神經(jīng)元損傷，從而改善阿爾茨海默癥；俞盈等［24］通過睡眠實驗發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜酸可有效改善睡眠，但目前還未見該成分抗帕金森病的研究。本實驗采用MPTP誘導的小鼠帕金森病模型來評價靈芝三萜抗帕金森病活性，發(fā)現(xiàn)該成分可顯著改善多巴胺能神經(jīng)元缺失、運動功能障礙，能為后續(xù)相關(guān)藥物開發(fā)奠定基礎，但其分子機制尚不明確，有待于進一步研究。