馬 霄，顏國華，王世廣，李曉婷，李登云，崔傳鋒

（1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院有限公司，上海 201203）

隱丹參酮屬于二萜醌類化合物，主要存在于丹參等植物中［1］，具有抗腫瘤、抗病毒、保肝、抗心絞痛等藥理作用［2］，對腦卒中、腦缺血、阿爾茨海默病等疾病療效較強［3-4］，并且本身毒性較?。?］。但該成分在水中的溶解度僅為 （0.96±0.05） μg／mL，油水分配系數(shù)logP值為1.78［6］，雖然在模擬胃液中的穩(wěn)定性良好，但在模擬腸液中會發(fā)生降解［7］，導(dǎo)致其口服生物利用度僅約為2%［8］。另外，將中藥活性成分制成口服給藥制劑時，作用機制明確，易獲得現(xiàn)代科學(xué)理論支撐，從而為其走向國際市場奠定基礎(chǔ)［9］。

目前，隱丹參酮相關(guān)制劑有納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體［10］、固體脂質(zhì)體［11］、納米混懸劑［12］、固體分散體［13］等。由于滴丸可增加藥物溶解度、溶出度、生物利用度［14-15］，并且生產(chǎn)成本低，故本實驗制備隱丹參酮滴丸，并考察其體內(nèi)藥動學(xué)，以期為臨床提供成本低、療效好的相關(guān)制劑。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DW-1 型全自動滴丸機（廣州市大祥電子機械設(shè)備有限公司）；FA2004B 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；HJ-6A 型磁力攪拌儀（常州德杜儀器有限公司）；RC12AD 型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；MDS-DCY12Q 型氮吹儀（深圳邁德施生物科技有限公司）。

隱丹參酮 （批號 110852-210126，純度99.0%）、非諾貝特 （批號100733-202006，純度99.9%） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）。隱丹參酮原料藥（批號201017，純度96.5%，南京普怡生物科技有限公司）。聚乙二醇4000 （PEG 4000，批號20200618，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；二甲基硅油 （型號 H201-50，批號20200316，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

家兔，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，雌雄兼具，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫） 2020-0001，實驗室適應(yīng)1 周。

2 方法與結(jié)果

2.1 隱丹參酮含量測定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.02% 磷酸（65 ∶35）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取20 粒本品，置于研缽中研細(xì)，取約40 mg 至三角燒瓶中，精密稱定，加入70% 乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲 （功率250 W） 處理20 min，靜置20 min，70%乙醇補足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 微孔濾膜，精密量取2 mL續(xù)濾液至50 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品24.40 mg，置于100 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解后稀釋定容，得244 μg／mL 貯備液，流動相依次稀釋至12.2、6.1、2.03、0.61、0.061、0.030 5 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得方程為Y＝64.847 1X+30.816 2 （r＝0.999 8），在0.030 5～12.2 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察 取“2.1.2” 項下供試品溶液適量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮含量RSD 為0.44%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取0.030 5、2.03、12.2 μg／mL 對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得隱丹參酮含量RSD 分別為0.82%、0.57%、0.20%，表明儀器精密度良好。取同一批滴丸，按“2.1.2”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮含量RSD 為1.49%，表明該方法重復(fù)性良好。精密稱取9 份滴丸粉末，每份約20 mg，置于三角瓶中，分為高、中、低3 組，分別加入貯備液15、10、15 mL，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮平均加樣回收率分別為100.26%、101.12%、99.81%，RSD分別為0.59%、0.73%、0.92%。

2.2 滴丸制備及質(zhì)量評價 參考文獻 ［15］報道。

2.2.1 制備過程 采用熔融法，稱取原料藥粉末（過100 目篩）、基質(zhì)適量，置于滴丸試驗機中，在75 ℃下加熱熔融，攪拌（轉(zhuǎn)速200 r／min） 30 min 至熔融液完全溶解澄清，冷凝液選擇二甲基硅油，調(diào)節(jié)其滴距后以一定滴速滴制（滴口內(nèi)徑2.5 mm，外徑4.0 mm），收集，搽拭干凈，即得。每組均滴制300 丸。

2.2.2 評價方法 挑選外觀圓整光滑的滴丸，計算成型率，公式為成型率＝（外觀圓整光滑滴丸數(shù)／總滴丸數(shù)） ×100%。取滴丸20 粒，精密稱定質(zhì)量，計算平均丸重W平均，再依次稱定每個滴丸質(zhì)量Wi，計算質(zhì)量差異，公式為質(zhì)量差異＝［（Wi-W平均）／W平均］ ×100%。

2.3 處方工藝優(yōu)化 采用單因素試驗。

2.3.1 PEG 4000 與PEG 6000 比例 PEG 4000、PEG 6000 均是滴丸制劑常用基質(zhì)［16］，課題組前期發(fā)現(xiàn)采用前者制得的熔融液黏度較低，液滴大小不均勻，滴速較快，難以控制；后者制得的熔融液黏度較高，滴速較慢，即單用兩者均會影響滴丸成型率、質(zhì)量差異［16］，故本實驗選擇其混合物作為基質(zhì)。固定基質(zhì)與隱丹參酮比例6 ∶1，冷凝溫度12 ℃，滴速35 滴／min，滴距7 cm，測定成型率、質(zhì)量差異，結(jié)果見圖1。由此可知，PEG 4000 與PEG 6000 比例為1 ∶1 時成型率較高，質(zhì)量差異較小，可能是由于在該比例下基質(zhì)熔點、熔融液黏度適中，滴速易于控制，熔融液滴大小均勻。

圖1 PEG 4000 與PEG 6000 比例對成型率、質(zhì)量差異的影響（n＝3）Fig．1 Effects of PEG 4000-PEG 6000 ratio on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.2 基質(zhì)與藥物比例 固定PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，冷凝溫度12 ℃，滴速35 滴／min，滴距7 cm，測定成型率、質(zhì)量差異，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著基質(zhì)用量增加，成型率先升高后趨穩(wěn)，而質(zhì)量差異先降低后趨穩(wěn)，可能是由于兩者比例影響了熔融液黏度所致；為7 ∶1、8 ∶1 時成型率較高，質(zhì)量差異較小，為了減少輔料用量，提高制劑載藥量，最終選擇7 ∶1。另外，隱丹參酮在PEG 4000 與PEG 6000 比例為1 ∶1 熔融液中的溶解度為0.35 g／g，表明基質(zhì)與藥物比例為7 ∶1 時后者可完全溶于前者中。

圖2 基質(zhì)與藥物比例對成型率、質(zhì)量差異的影響（n＝3）Fig．2 Effects of matrix-drug ratio on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.3 冷凝溫度 固定PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，基質(zhì)與藥物比例7 ∶1，滴速35 滴／min，滴距7 cm，測定成型率、質(zhì)量差異，結(jié)果見圖3。由此可知，冷凝溫度過低時滴丸冷凝較快，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致成型率較低，質(zhì)量差異較大；冷凝溫度過高時滴丸冷凝較慢，下沉至滴丸機底部后撞擊使其變形，導(dǎo)致成型率降低，但進一步升溫對滴丸質(zhì)量影響不大，最終選擇12 ℃。

圖3 冷凝溫度對成型率、質(zhì)量差異的影響（n＝3）Fig．3 Effects of condensate temperature on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.4 滴速 固定PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，基質(zhì)與藥物比例7 ∶1，冷凝溫度12 ℃，滴距7 cm，測定成型率、質(zhì)量差異，結(jié)果見圖4。由此可知，滴速過慢，熔融態(tài)液滴變大，質(zhì)量差異較大；滴速過快，滴丸容易粘連［17］，成型率較低，質(zhì)量差異也較大；為30、35 滴／min 時成型率均大于90%，質(zhì)量差異均小于10%，考慮到制備效率，最終選擇35 滴／min。

圖4 滴速對成型率、質(zhì)量差異的影響（n＝3）Fig．4 Effects of dropping speed on forming rate and weight difference （n＝3）

2.3.5 滴距 固定PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，基質(zhì)與藥物比例7 ∶1，冷凝溫度12 ℃，滴速35 滴／min，測定成型率、質(zhì)量差異，結(jié)果見圖5。由此可知，滴距過小時熔融態(tài)液滴進入冷凝液的時間較短，未完全收縮成規(guī)則球形，導(dǎo)致成型率較低；滴距過大時熔融態(tài)液滴撞擊冷凝液面后易導(dǎo)致形變，進而影響成型率；為7 cm 時成型率、質(zhì)量差異均較理想。

圖5 滴距對成型率、質(zhì)量差異的影響（n＝3）Fig．5 Effects of dropping distance on forming rate and weight difference （n＝3）

2.4 驗證試驗 根據(jù)“2.3” 項下結(jié)果，確定最優(yōu)處方工藝為PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，基質(zhì)與藥物比例7 ∶1，滴速35 滴／min，冷凝溫度12 ℃，滴距7 cm。按上述優(yōu)化工藝平行制備3 批樣品，進行驗證試驗，測得平均成型率為（94.86±1.18）%，質(zhì)量差異為（8.89±0.72）%，表明該工藝重復(fù)性良好。

2.5 溶散時限檢查 取6 粒滴丸，設(shè)定篩網(wǎng)孔徑為2.0 mm （20 粒滴丸平均直徑為3.98 mm），采用加擋板法測得平均溶散時限為（7.1±0.2） min。

2.6 溶解度測定 取過量原料藥、物理混合物（原料藥+空白基質(zhì)，比例同滴丸）、滴丸至蒸餾水中，25 ℃水浴中磁力攪拌（800 r／min） 2 d，取上層混懸液，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，三者溶解度分別為 （0.96±0.05）、（1.07±0.06）、（38.93±2.96） μg／mL，即滴丸可將原料藥溶解度提高至40.55 倍。

2.7 掃描電鏡分析 取原料藥、空白基質(zhì)（PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，僅簡單混合）、物理混合物（原料藥+空白基質(zhì)，比例同滴丸，研細(xì)）、滴丸粉末適量，噴金60 s 后在掃描電鏡上觀察形態(tài)，結(jié)果見圖6。由此可知，原料藥呈長方體晶體形態(tài)（圖6A），空白基質(zhì)呈片狀形態(tài)（圖6B），物理混合物中原料藥、空白基質(zhì)僅是簡單混合（圖6C），滴丸中未發(fā)現(xiàn)原料藥長方體晶體形態(tài)（圖6D），表明原料藥在滴丸中的存在形式發(fā)生了改變。

圖6 各樣品掃描電鏡圖Fig．6 Scanning electron microscope images of various samples

2.8 晶型分析 設(shè)定掃描速度為6°／min，掃描范圍（2θ） 為3°～45°，Cu-Kα 靶。取原料藥、空白基質(zhì)（PEG 4000 與PEG 6000 比例1 ∶1，僅簡單混合）、物理混合物（原料藥+空白基質(zhì)，比例同滴丸）、滴丸粉末適量，置于玻璃槽后進行X 射線粉末衍射掃描，結(jié)果見圖7。由此可知，原料藥在7.5°、8.8°、12.6°、25.3°等處出現(xiàn)特征晶型峰；物理混合物圖譜中上述特征晶型峰仍可見，但強度下降，表明原料藥晶型狀態(tài)未改變；滴丸圖譜中上述特征晶型峰均消失，僅發(fā)現(xiàn)空白基質(zhì)特征衍射峰，表明原料藥轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形狀態(tài)。

圖7 各樣品X 射線粉末衍射圖Fig．7 X-ray powder diffraction patterns for various samples

2.9 體外溶出度研究 前期發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮在1.5%SDS 溶液中的溶解度為8.74 μg／mL。取原料藥、物理混合物（比例同滴丸）、滴丸適量（均含2 mg 隱丹參酮），置于轉(zhuǎn)籃中，設(shè)定溶出介質(zhì)為900 mL 0.5%SDS 溶液，溶出儀介質(zhì)溫度、轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速分別為（37±1）℃、100 r／min，于10、15、30、45、60、90、120、180 min 各取樣3 mL，并補充空白介質(zhì)5 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖8。由此可知，原料藥、物理混合物180 min 內(nèi)累積溶出度分別為27.46%、29.11%，表明基質(zhì)對原料藥具有一定促溶作用，但效果不明顯，而滴丸45 min內(nèi)累積溶出度即達94.74%。

圖8 隱丹參酮體外釋藥曲線（n＝6）Fig．8 In vitro drug release curves for cryptotanshinone （n＝6）

2.10 穩(wěn)定性考察 取滴丸適量，密封后置于溫度40 ℃、相對濕度75% 的恒溫恒濕箱中，于0、1、2、3、6 個月后取出，測定水分、質(zhì)量差異、溶散時限。結(jié)果見表1。由此可知，滴丸在加速條件下放置6 個月后外觀、水分、重量差異、溶散時限仍符合2020 年版《中國藥典》 丸劑項下要求。

表1 穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab．1 Results of stability investigation （n＝3）

2.11 體內(nèi)藥動學(xué)研究

2.11.1 分組、給藥與采血 18 只家兔隨機分為隱丹參酮組、物理混合物組（藥物與基質(zhì)比例同滴丸）、隱丹參酮滴丸組，禁食過夜，將原料藥、物理混合物分散于0.5%CMC-Na 溶液中進行灌胃給藥，滴丸使用溫水送服，劑量均為40 mg／kg（以隱丹參酮計），乙醚麻醉后隱丹參酮組、物理混合物組家兔于0、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8 h 采血，隱丹參酮滴丸組家兔增加12 h 采血點，采血量均約為0.5 mL，引流至肝素浸潤離心管中，渦旋5 s，4 000 r／min 離心3 min，取上層血漿密封，在-20 ℃下冷凍保存。

2.11.2 血漿樣品處理 參考文獻［18］ 報道，精密吸取100 μL 血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液（取非諾貝特對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度為500 ng／mL，即得） 50 μL、乙腈1 mL，渦旋30 s，12 000 r／min 離心10 min，取上層有機相，45 ℃氮氣吹干得殘渣，100 μL 乙腈復(fù)溶。

2.11.3 線性關(guān)系考察 取1 000 ng／mL 對照品溶液適量，甲醇依次稀釋至500、250、100、50、25 ng／mL，精密取0.5 mL，45 ℃氮氣吹干，加入0.5 mL 空白血漿，渦旋30 s 后按“2.11.2” 項下方法處理，即得血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），隱丹參酮、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得方程為Y＝0.002 3X+0.082 7 （r＝0.995 6），在25～1 000 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.11.4 方法學(xué)考察 取25、500、1 000 ng／mL血漿對照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得隱丹參酮峰面積RSD分別為4.12%、3.05%、3.22%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；同法連續(xù)測定6 d，每天1 次，測得隱丹參酮峰面積RSD 分別為7.62%、5.47%、4.98% （n＝6），表明該方法日間精密度良好。取給藥8 h 后血漿樣品適量，室溫（溫度25 ℃，相對濕度55%） 下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮、內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 為8.48% （n＝6），表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好?？瞻籽獫{配制隱丹參酮質(zhì)量濃度分別為25、250、1 000 ng／mL 的血漿樣品，按“2.11.2” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下各進樣測定3 次，測得隱丹參酮平均加樣回收率分別為90.10%、95.72%、94.22%，RSD 分別為3.84%、7.15%、5.29%。

2.11.5 結(jié)果分析 血藥濃度-時間曲線見圖9，再采用3P97 程序統(tǒng)計矩模型計算主要藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。由此可知，與原料藥比較，物理混合物tmax、t1／2、Cmax、AUC0～t無明顯變化（P＞0.05），表明基質(zhì)對隱丹參酮藥動學(xué)基本無影響，促吸收作用有限；與原料藥、物理混合物比較，滴丸tmax縮短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度與原料藥相比增加至2.70 倍。

表2 隱丹參酮主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab．2 Main pharmacokinetic parameters for cryptotanshinone （±s，n＝6）

表2 隱丹參酮主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab．2 Main pharmacokinetic parameters for cryptotanshinone （±s，n＝6）

注：與隱丹參酮比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與物理混合物比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

參數(shù)單位隱丹參酮物理混合物隱丹參酮滴丸tmaxh1.03±0.260.94±0.230.52±0.14*＃t1／2h2.89±0.683.07±0.632.92±0.72 Cmaxng·mL-1368.79±92.04402.65±107.62808.36±186.10**＃＃AUC0 ～tng·mL-1·h1 033.18±162.431 098.04±177.462 794.44±238.73**＃＃AUC0～∞ng·mL-1·h1 076.45±171.061 127.79±184.602 903.65±255.67**＃＃

圖9 隱丹參酮血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig．9 Plasma concentration-time curves for cryptotanshinone （n＝6）

3 討論

固體分散體易吸潮［19］，可能會影響藥物穩(wěn)定性及藥效，故需經(jīng)壓片、填充膠囊等過程才能供臨床使用。納米混懸劑［12］、固體脂質(zhì)納米粒［11］等納米制劑對設(shè)備要求較高，固化成粉末時需大量凍干保護劑，導(dǎo)致制劑載藥量較低，并且在儲存過程中或口服進入胃腸道后會發(fā)生粒徑增長情況［20-21］，可能導(dǎo)致促吸收作用減弱。滴丸工藝簡便，質(zhì)量易控，適合目前我國中藥企業(yè)實際生產(chǎn)水平，故本實驗將隱丹參酮制成滴丸，以期為臨床提供一種可靠實用、價格低廉、安全有效的口服制劑。

晶型分析、掃描電鏡結(jié)果表明，隱丹參酮以無定形狀態(tài)存在于滴丸中，有利于溶解度、溶出速率、溶出度的提高；滴丸45 min 內(nèi)累積溶出度達94.74%，可為改善藥物吸收奠定基礎(chǔ)。體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果表明，滴丸tmax縮短，可能與藥物溶出速率較快有關(guān)；Cmax增加至2.19 倍，可能是由于隱丹參酮累積溶出度升高所致；相對生物利用度提高至2.70 倍，可能是因為滴丸提高了隱丹參酮溶解度、溶出速率、溶出度，解決了其吸收瓶頸［22］，并且原料藥在滴丸中以無定形狀態(tài)存在，往往具有更高的生物利用度［15，23］。今后，需對隱丹參酮滴丸不良反應(yīng)、藥效等方面進行評價，以期為該制劑提供更完整的研究資料。