張桓碩,張 瑞,趙興剛,劉 俊,林明玥,王晨鑫,李雨帆,陳 立,鄒 琴*

(1.四川大學分析測試中心納米生物材料研究中心,四川成都 610065;2.深圳蔚多科技有限公司,廣東深圳 518000;3.廣西蔚多科技有限公司,廣西防城港 538000;4.四川大學分析測試中心,四川成都 610065)

西湖龍井草本液是以龍井提取物、薄荷腦為主要抗菌成分的中藥草本液產品,其主要功能為抗菌消炎、清熱解毒、利咽潤喉,主要使用方式為霧化吸入。中藥結合霧化技術區(qū)別于傳統(tǒng)的聞香吸入和煙熏吸入,形成了新型給藥模式,有著霧化顆粒小、易吸收、藥物利用率高的特點,可以針對治療呼吸系統(tǒng)炎癥[1]。龍井提取物含有的茶多酚和薄荷醇2種中藥材料提取物均具有廣譜抗菌性能,將茶多酚與薄荷醇聯(lián)合使用的抗菌機理的研究鮮見報道。為驗證本草本液療效,開展對草本液的體外抗菌活性和抗菌機理的研究。該研究選取了革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)3種菌,這3種菌均為人類活動中易接觸的致病菌種。大腸桿菌易導致腸道外感染,如化膿性感染或者泌尿道感染;金黃色葡萄球菌易導致化膿性感染,如毛囊炎、傷口化膿等;白色念球菌可以造成皮膚、黏膜、內臟和中樞神經系統(tǒng)的急、慢性感染[2]。該研究通過測定草本液對這3種菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration、MIC)、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)來研究其抗菌效果,利用抑菌環(huán)試驗、Live-Dead 熒光染色以及掃描電子顯微鏡試驗考察草本液對3種菌的抗菌活性以及細菌表面微觀結構在草本液作用前后的變化,研究天然植物中藥提取物的抗菌機理。

1 材料與方法

1.1 試劑西湖龍井草本液(深圳蔚多科技有限公司);金黃色葡萄球菌(CMCC26003)、大腸桿菌(CMCC(B)44102)、白色念球菌[CMCC(F)98001]均購自上海保藏生物技術中心;營養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術有限公司);磷酸鹽緩沖液藥片(phosphate buffer solution,PBS,賽默飛世爾科技有限公司);生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司);無水乙醇(成都市科隆化學品有限公司);掃描電鏡專用固定液(北京索萊寶科技有限公司);胰蛋白胨(上海阿拉丁試劑有限公司);Live-Dead試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司);青霉素鈉(山東圣旺藥業(yè)股份有限公司);冰乙酸(上海阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 儀器掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM,型號HITACH S530,日本電子株式會社);無菌工作臺(型號SW-CJ-2FD,蘇州凈化設備有限公司);立式蒸汽滅菌鍋(型號YXQ-LB-50SII,上海博迅實業(yè)有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(型號SPX-160B-2,上海?，攲嶒炘O備有限公司);精密電子天平(型號BT-25S,德國Sartorius AG 集團);熒光倒置顯微鏡(型號Eclipse TI-U,日本Nikon公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1細菌培養(yǎng)。稱取3 g胰蛋白胨于試劑瓶中,加入100 mL蒸餾水,超聲分散至溶解,得液體培養(yǎng)基,立式蒸汽滅菌鍋滅菌(表壓1.7 kg/cm2,121 ℃,30 min),冷卻備用。取營養(yǎng)瓊脂33 g,加入1 000 mL蒸餾水中,超聲分散溶解,立式蒸汽滅菌鍋滅菌,倒入培養(yǎng)皿,放涼后得固體培養(yǎng)基備用。取少量甘油封存的細菌接種于液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后備用[3]。

1.3.2抑菌率測定。分別將100 μL菌液(1×104～9×104CFU/mL)加入4管5 mL草本原液(試驗組)或4管5 mL生理鹽水(對照組),混合均勻,分別作用2、5、10、20 min后,各取0.5 mL加入含5 mL PBS 的試管內,充分混勻后,PBS稀釋102、103倍后接種于固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h,進行活菌菌落計數(shù)。試驗重復3次,按下式計算抑菌率:

式中:α為抑菌率(%);β為生理鹽水對照組平均菌落數(shù)(CFU);γ為草本原液試驗組平均菌落數(shù)(CFU)。

1.3.3抑菌環(huán)測定。移取100 μL菌液(1×106～1×108CFU/mL)與10 mL未凝固的固體培養(yǎng)基混合,倒入培養(yǎng)皿,分別取草本原液(試驗組)、丙三醇(對照組)滴加于空白紙片5 mm圓形濾紙片若干,并置于混合細菌的固體培養(yǎng)基上,放37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h,拍照并計算抑菌圈直徑,試驗重復3次[4]。

1.3.4MIC和MBC測定。在96孔板中,每孔加入100 μL液體培養(yǎng)基,一列共12孔。利用對倍稀釋法,在第1孔處加入100 μL草本原液后混勻,然后從第1孔用移液槍吸取100 μL混合液(草本原液濃度50%)加至第2孔后混勻,再在第2孔吸取100 μL(草本原液濃度25%)加至第3孔,混勻。如此重復稀釋至第11孔,在第11孔吸取100 μL棄去,第12孔為不含樣本的對照。向每孔加入100 μL菌液(0.5×106～0.5×108CFU/mL)。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以肉眼觀察,藥物濃度最低且培養(yǎng)基不出現(xiàn)渾濁,無細菌生長孔即是該菌的MIC。確認MIC后,用接種環(huán)分別蘸取包括MIC濃度孔的左右共5孔的樣本并接種于固體培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用活菌計數(shù)法檢查菌落數(shù),平均數(shù)小于5個的最小稀釋濃度即為該菌的MBC[5]。試驗均重復3次以上。

1.3.5Live-Dead染色。在2個96孔板中將100 μL菌液分別加入100 μL草本原液(試驗組)、100 μL丙三醇(陰性對照組)、100 μL冰乙酸[6](白色念珠菌陽性對照組)、100 μL青霉素鈉(0.192 mg/mL,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌陽性對照組),最終菌液濃度為5× 105～5 × 107CFU/mL。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2和5 min。避光條件下,分別將等量 Live-Dead 試劑A液和B液混合得到Live-Dead染色劑。將染色劑加入96孔板中,混勻后孵育20 min,使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6SEM觀察。在24孔板中放入無菌圓形玻片,移取100 μL菌液(1×106～1×108CFU/mL)與100 μL草本原液樣本于24孔板中,培養(yǎng)24 h后吸出樣本菌液混合液體后,將玻片用PBS清洗1次,然后使用掃描電鏡專用固定液固定1.5 h,再用梯度乙醇溶液(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)進行脫水(其中100%乙醇脫水3次),每個梯度脫水10 min,真空干燥12 h,樣品表面噴金,使用SEM觀察樣品表面細菌表面結構[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法采用Excel 軟件的T.TEST函數(shù)進行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用獨立樣本t檢驗;以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 抑菌率草本液原液對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液(1×104～9×104CFU/mL)不同作用時間下抑菌率如表1所示,37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后,根據(jù)固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)計算出草本原液對3種菌的抑菌率,草本原液對3種菌有較強的抑制作用且原液在與菌液接觸的2 min內就表現(xiàn)出明顯的抑菌作用,不同作用時間草本液的抑菌率均大于99.9%。

表1 草本原液作用于3種菌的抑菌率

2.2 抑菌環(huán)草本液原液滴加于5 mm濾紙片作用后的白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)和抑菌環(huán)直徑如圖1所示,草本原液作用后的3種菌均出現(xiàn)了抑菌環(huán)(圖1a～c),其直徑分別為(8.1±0.5)、(8.4±0.3)、(9.9±0.3)mm,與草本原液作用有顯著差異(P<0.001),草本原液與對照丙三醇作用也有顯著差異(P<0.001),表明草本原液對3種菌均有抑制作用。草本液作用的金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)顯著大于白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌環(huán),可知草本原液對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于對白色念珠菌和大腸桿菌的抑制作用(P<0.001)。

注:a.白色念珠菌;b.大腸桿菌;c.金黃色葡萄球菌。d.***P<0.001。

2.3 MIC和MBC表2是白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在不同倍數(shù)和濃度原液的作用下的生長情況。從表2可以看出,2倍是培養(yǎng)基不出現(xiàn)渾濁且藥物濃度最低的稀釋倍數(shù),而到了3倍則抑菌效果顯著下降,孔內較為渾濁,生長了大量的真菌細菌。故將草本原液對3種菌的MIC定為2倍稀釋濃度。

表3是用接種環(huán)蘸取2倍稀釋倍數(shù)左右5孔樣本的3種菌并接種在固體培養(yǎng)基上的生長情況。從表3可以看出,1倍和2倍平均菌落數(shù)量均少于5個,而3倍及以上稀釋濃度的3種菌在固體培養(yǎng)基上則生長了大量菌落。故確定草本原液對3種菌的MBC為2倍稀釋濃度。

表3 不同稀釋倍數(shù)草本液與3種菌作用后菌落生長情況

2.4 活死細菌熒光染色活死細菌染液的成分為 SYTO9染色劑(鈣黃素AM,A液)和PI染色劑(碘化丙啶,B液)。A液在單獨使用時,將標記樣品內所有的菌種(無論活死);B液在單獨使用時,將標記細胞壁破損的細菌真菌。將A液與B液混合加入樣品后使用熒光倒置顯微鏡觀察,B液將抑制A液產生的熒光,從而區(qū)分菌種的活(綠光)死(紅光)。從圖2和圖3可以看出,陰性對照組(丙三醇)的白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有大量綠色熒光,紅色熒光幾乎不可見,說明3種菌均生長狀態(tài)良好,具有較強的活性。同時陽性對照組(青霉素鈉)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和陽性對照組(冰乙酸)對白色念珠菌有大量紅色熒光而且綠色熒光幾乎不可見,說明陽性對照組中有大量死菌且活菌幾乎不可見。而草本原液作用2和5 min的白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,均有大量紅色熒光,而綠色熒光存在較少。因此,試驗組中死菌大量可見而活菌幾乎不可見。上述現(xiàn)象說明3種菌與草本原液作用2和5 min內大量菌死亡,表明草本原液有較強的抑菌能力,也印證了抑菌率中原液在與菌液接觸的2 min內就表現(xiàn)出明顯抑菌作用的結論。

注:陽性對照組中白色念珠菌使用冰乙酸;大腸桿菌和金黃色葡萄球菌使用青霉素鈉。

注:陽性對照組中白色念珠菌使用冰乙酸;大腸桿菌和金黃色葡萄球菌使用青霉素鈉。

2.5 細菌表面結構變化從圖4可以看出,在SEM下正常生長的白色念珠菌形態(tài)飽滿,呈球形,表面光滑,菌體完整,有菌絲,呈念珠狀;經草本原液作用的白色念珠菌表面明顯缺損,無菌絲,菌體周圍可見大量碎絮狀物質。 正常生長的大腸桿菌呈桿狀,表面光滑,形態(tài)完整,菌體完好;經原液作用后的大腸桿菌長度短小,菌體皺縮,表面結構變得粗糙,部分菌體皺縮、干癟、變形,細菌形態(tài)受到嚴重破壞,菌體周圍可見大量碎片狀物質。金黃色葡萄球菌球形飽滿充盈、呈葡萄狀聚團、外表致密光滑;經原液作用的金黃色葡萄球菌外表嚴重皺縮,粗糙。

圖4 草本原液和生理鹽水對3種菌表面形態(tài)作用的掃描電子顯微鏡照片

3 討論

對比抗生素藥物,中藥治療感染有著獨特的優(yōu)勢,中藥來源廣、活性成分多樣、不易產生耐藥性,因此可以成為抗耐藥菌感染的新寶庫[8]。早在20世紀50年代我國醫(yī)藥工作者即開始了中藥抑菌作用與抑菌成分研究,并發(fā)現(xiàn)許多具備抗菌作用的中藥[9]。該研究的草本液主要成分為龍井提取物、薄荷腦、甘油,其中茶多酚和薄荷醇為草本液的主要抗菌成分。草本液含有的龍井提取物含有包括茶多酚、生物堿、芳香物質在內的500多種物質[10],其中茶多酚是茶葉的主要有效成分,有著廣譜有效抑菌功能,同時也有抗病毒、抗癌、抗氧化作用[11]。牛知慧等[12]通過西湖龍井的茶多酚提取物對多種細菌進行抗菌試驗,證實了茶多酚具備較強抗菌性能。茶多酚通過與細菌細胞壁結合使得細胞壁的通透性增加,其內容物、金屬離子和蛋白質外泄,最終導致細菌代謝發(fā)生紊亂,從而產生直接的抗菌作用[13]。中藥薄荷腦又稱薄荷醇,廣泛應用于食品工業(yè)、制藥工程、日用化工等行業(yè),也具備廣譜抗菌性能[14],有著治療風熱感冒、頭痛、目赤、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風疹的作用[15]。薄荷醇是一種天然環(huán)狀萜醇類化合物,對白色念珠菌的外毒素、菌絲和被膜的產生起到抑制作用[16]。同時,低濃度的薄荷醇可以顯著抑制金黃色葡萄球菌中的α-溶血素、腸毒素A和B以及中毒性休克綜合征毒素1的表達[17],薄荷醇干擾白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的外毒素等表達而非干擾菌種的生長,從而大大降低細菌的感染能力。

在抑菌率試驗中,本草本液對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不同時長的抑菌率均大于99.9%。MIC和MBC試驗說明該草本液有在2倍稀釋濃度下殺滅白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的能力。在抑菌環(huán)試驗中,3種菌均出現(xiàn)抑菌圈,而且金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌圈。根據(jù)李德全等[14]的研究,由于白色念珠菌為真菌,細胞結構相對復雜,其對消毒因子的敏感性一般弱于細菌。而大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,2種菌在細胞壁成分結構功能上有很大不同,可能導致大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)的大小差異。以上試驗可以證明草本液有較強的抗菌功能。SEM觀察草本液作用后的3種菌,茶多酚對3種菌的作用導致細胞壁皺縮粗糙甚至疑似破損,充分驗證了以上抗菌機理。同時,占茶多酚總量65%～80%的兒茶素成分也通過抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長對數(shù)期具備抑菌效果[18]。

茶多酚聯(lián)合薄荷醇將進一步提高草本液聯(lián)合抗菌的能力,茶多酚與細胞壁結合破壞其通透性,薄荷醇干擾菌種外毒素表達而不抑制菌種生長。該草本液通過霧化作用直接作用于呼吸系統(tǒng),雖然體外抗菌試驗已證明其有抗菌活性,但是通過霧化作用的治療效果還需要進一步研究,因此需要該草本液霧化后進行動物試驗以確定其作用效果,也需要對所研究中藥提取物分離、純化、鑒定,以確定其抗菌活性和抗菌機理,進一步研發(fā)出人體無害、治療效果好、作用機理明確的中藥草本液。