楊 雁,金鵬程,李林玉,楊 斌,王 馨,金 航

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,云南昆明 650200)

滇龍膽(GentianarigescensFranch.)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)多年生草本植物,以根和根莖入藥,性苦寒,歸肝膽經(jīng),具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1],是我國常用大宗藥材,具有悠久的藥用歷史,為歷版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《藥典》)收載的龍膽基原植物之一,是我國傳統(tǒng)中藥復(fù)方龍膽瀉肝丸、龍膽瀉肝片等180多種中成藥的主要原料[2]。趙志蓮等[3-4]研究表明,龍膽屬藥用植物的主要活性成分是環(huán)烯醚萜類,其中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷是其主要藥效成分,是滇龍膽質(zhì)量評價的重要指標(biāo)[5-8]。產(chǎn)地初加工方法是影響中藥材品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素,決定了中藥材、中藥飲片及制劑的質(zhì)量[9],是影響中藥臨床應(yīng)用安全性和有效性的一項源頭性工序[10]。藥用植物在采收后會發(fā)生細(xì)胞縮水、破裂、變性、酶解、后熟、干燥等變化,根據(jù)藥材性質(zhì)和商品銷售、運輸和保管的要求,對中藥材進行去除非藥用部位、清洗、干燥等產(chǎn)地初加工,防止其霉變蟲蛀,便于運輸儲存,保障中藥材質(zhì)量[9]。因此科學(xué)合理的產(chǎn)地初加工方法至關(guān)重要。

不同的產(chǎn)地初加工方法直接影響藥材的質(zhì)量,羅寅珠等[11]研究發(fā)現(xiàn)半夏藥材曬干處理后外觀性狀較好、密度高,質(zhì)堅實,藥效成分含量整體較高;劉勇等[12]研究發(fā)現(xiàn)陰干法處理后的三七藥材質(zhì)地堅實,內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密,外觀性狀較好,并且藥效成分含量較高。傳統(tǒng)本草記載滇龍膽藥材產(chǎn)地加工方法多為采后陰干[13-15],但當(dāng)前滇龍膽人工種植面積較大,陰干場地和天氣原因極大地限制了滇龍膽產(chǎn)地加工規(guī)?；l(fā)展。近年來,已有學(xué)者開展了滇龍膽產(chǎn)地加工研究,吳昕怡等[16]采用熱燙的方法對滇龍膽進行加工處理,發(fā)現(xiàn)熱燙處理后滇龍膽中3種有效成分的OD值呈先升高后降低的趨勢;劉秀嶶等[17]研究了不同光質(zhì)對滇龍膽藥材干燥品質(zhì)的影響,結(jié)果顯示綠光能降低滇龍膽水分含量,并且顯著提高其龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和馬錢苷酸的含量;沈濤等[18-21]對滇龍膽適生區(qū)范圍和生物氣候特征進行研究,以期為野生滇龍膽資源保護、持續(xù)利用與產(chǎn)地鑒別提供依據(jù)。但此類研究多是圍繞滇龍膽資源分布、化學(xué)成分、藥理作用、產(chǎn)地鑒別等方面開展,有關(guān)滇龍膽產(chǎn)地初加工方法的研究不多,很多加工方法并未結(jié)合生產(chǎn)實際,推廣應(yīng)用性不強,且在加工后藥材整體質(zhì)量評價方面研究較少。為探索不同加工方法對滇龍膽藥材質(zhì)量的影響,該研究采用9種不同的產(chǎn)地初加工方法,以滇龍膽的根及根莖為研究對象,測定干燥后滇龍膽樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷含量,以及總灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指標(biāo),依據(jù)《藥典》,對樣品進行綜合評價,以期為滇龍膽產(chǎn)地初加工規(guī)范化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。試驗用新鮮滇龍膽藥材樣品,于2021年12月采自臨滄市云縣茂蘭鎮(zhèn),經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)植物滇龍膽(GentianarigescensFranch.)。

1.1.2儀器。ThermoFisher高效液相色譜儀UltiMate 3000系列(LPG-3400SD泵,WPS-3000SL全自動進樣器,DAD-3000紫外可見檢測器,190～900 nm);萬分之一電子分析天平(賽多利斯電子天平);TB-5200DT型超聲波清洗儀(天津市泰斯特聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)公司);101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)公司)。

1.1.3試劑。龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷對照品均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)公司,批號分別為9306、9415、3456、7001。甲醇、乙腈(美國Fisher試劑公司);醋酸、磷酸(羅恩試劑公司,色譜純);水(自制超純水)。

1.2 試驗方法

1.2.1不同初加工方法。采用9種不同初加工方法對樣品進行處理,具體方法見表1。

表1 9種不同初加工方法(n=4)

1.2.2總灰分的測定。參照《藥典》(2020版)[1]龍膽灰分測定法,測定用樣品混合均勻后粉碎過100目篩,取3～5 g置熾灼至恒重的坩堝中,稱定重量(準(zhǔn)確至0.01 g),逐漸升高溫度至500～600 ℃,待樣品完全灰化并至恒重,稱重,根據(jù)殘渣重量,計算樣品中總灰分的含量(%)。

1.2.3酸不溶性灰分的測定。取“1.2.2”項所得的灰分,加入稀鹽酸10 mL至坩堝中,坩堝用表面皿覆蓋,放置在水浴上加熱10 min,用5 mL熱水沖洗表面皿,洗液并入坩堝中,然后用無灰濾紙過濾,坩堝內(nèi)的殘渣用水洗于濾紙上,并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣和濾紙移置同一坩堝中,干燥,熾灼至恒重。根據(jù)殘渣重量,計算樣品中酸不溶性灰分的含量(%)。

1.2.4浸出物的測定。參照《藥典》(2020版)[1]龍膽浸出物測定法(通則2201),取樣品2～4 g,精密稱定,置于 250 mL的錐形瓶中,精密加水100 mL,密塞,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用水補足減少的重量,搖勻后用干燥過濾器過濾,精密量取濾液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,再置于干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量。以干燥品計算樣品中水溶性浸出物的含量(%)。

1.2.5有效成分含量的測定。

1.2.5.1色譜條件。4個有效成分的色譜柱均為Thermo液相色譜柱(AcclaimTM120A C18;250 mm×4.6 mm,5 μm);流速1.000 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30.0 ℃。馬錢苷酸流動相為乙腈-0.1%醋酸(9∶91),檢測波長254 nm,理論塔板數(shù)不低于3 000;龍膽苦苷流動相為甲醇-水(25∶75),檢測波長270 nm,理論塔板數(shù)不低于3 000;獐牙菜苦苷流動相為甲醇-0.05%磷酸(18∶82),檢測波長237 nm,理論塔板數(shù)不低于5 000;當(dāng)藥苷流動相為甲醇-水(18∶82),檢測波長247 nm,理論塔板數(shù)不低于6 000。

1.2.5.2供試品溶液制備。龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷的制備分別參照《藥典》(2020版)秦艽、龍膽、青葉膽、當(dāng)藥的含量檢測方法制備。

1.2.5.3對照品溶液制備。精密稱取對照品龍膽苦苷7 mg、馬錢苷酸8 mg、獐牙菜苦苷7 mg和當(dāng)藥苷10 mg,分別用適量甲醇定容至25 mL,搖勻,4 ℃避光保存,備用。

1.2.5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取“1.2.5.3”項下的對照品溶液各5 mL,定容至10 mL容量瓶中,連續(xù)等梯度稀釋0.5倍6次,得到不同濃度梯度對照品溶液。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得出回歸方程,結(jié)果見表2。

表2 龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 26軟件對4種有效成分含量以及總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測定結(jié)果進行方差分析、聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥溫度對滇龍膽有效成分含量的影響該研究設(shè)計了7組干燥溫度、自然陰干、自然曬干共9個處理。將采收的新鮮滇龍膽按標(biāo)準(zhǔn)進行去雜質(zhì)、去除非藥用部位、清洗等加工步驟,樣品混勻后隨機分組,每組試驗設(shè)置4個重復(fù),9個處理的具體方法見表1,分析結(jié)果見表3。

表3 不同干燥溫度對滇龍膽有效成分含量的影響(n=4)

從表3可以看出,不同干燥溫度條件下,40 ℃干燥溫度條件下龍膽苦苷含量最高,平均值達(dá)9.25%,是《藥典》(2020版)規(guī)定(龍膽苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,同時,測定的馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷含量也較高;曬干的樣品龍膽苦苷含量最低,僅為5.65%,比40 ℃烘干樣品龍膽苦苷含量低3.60百分點,但曬干樣品的龍膽苦苷含量也達(dá)到了《藥典》(2020版)規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)。因此,40 ℃為滇龍膽烘干的最佳溫度,在設(shè)計不同加工方法中滇龍膽的干燥溫度選擇40 ℃。

2.2 不同加工方法對滇龍膽總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影響滇龍膽加工過程中,總灰分、酸不溶性灰分和浸出物是《藥典》(2020版)中評價藥材質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。從表4可以看出,所有免洗處理(MXYG、WMYG、WMSG、MXSG)樣品的總灰分均顯著高于水洗樣品,其中,免洗陰干(MXYG)處理樣品的總灰分最高,為9.08%,是《藥典》(2020版)規(guī)定(總灰分不得過7.0%)的1.30倍;酸不溶性灰分也是免洗處理樣品高于水洗樣品,按照《藥典》規(guī)定酸不溶性灰分不得過3.0%,免洗陰干(MXYG)處理樣品的酸不溶性灰分最高,為5.52%,是《藥典》(2020版)規(guī)定的1.84倍;免洗陰干(MXYG)和微波免洗陰干(WMYG)處理樣品的浸出物顯著低于其他處理,按照《藥典》(2020版)規(guī)定的水溶性浸出物不得少于36.0%,免洗陰干(32.40%)和微波免洗陰干(28.17%)處理后的樣品達(dá)不到《藥典》(2020版)標(biāo)準(zhǔn)。水洗烘干(SXHG)處理樣品的總灰分、酸不溶性灰分和浸出物均達(dá)到了《藥典》(2020版)標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同初加工方法對總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影響(n=4)

2.3 不同加工方法對滇龍膽中4種有效成分含量的影響從表5可以看出,不同加工處理方法滇龍膽中4種有效成分含量有一定差異。其中,水洗烘干(SXHG)處理滇龍膽的龍膽苦苷含量最高,為9.25%,是《藥典》(2020版)規(guī)定(龍膽苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,免洗微波處理1 min后曬干(WMSG)樣品的龍膽苦苷含量最低(4.62%),是《藥典》(2020版)標(biāo)準(zhǔn)的3.08倍;水洗烘干(SXHG)處理滇龍膽的馬錢苷酸含量也顯著高于其他處理;同時,水洗烘干處理的干燥時間最短,僅為12 h,遠(yuǎn)低于其他處理。

表5 不同初加工方法對滇龍膽有效成分含量的影響(n=4)

2.4 聚類分析對9種不同加工方法處理的36批(n=4)滇龍膽樣品進行聚類分析,結(jié)果見圖1。由圖1可知,當(dāng)臨界值在5時,可將加工方法分為4大類,其中,WSYG、SXYG、MXYG處理樣品劃分為第1類,此類樣品龍膽苦苷含量相近;SXHG處理樣品單獨劃分為第2類,此類樣品龍膽苦苷含量最高;WMSG處理樣品劃分為第3類,此類樣品龍膽苦苷含量最低;WMYG、WSSG、MXSG和SXSG處理樣品劃分為第4類,此類樣品龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、馬錢苷酸和當(dāng)藥苷含量相近。當(dāng)臨界值在10時,可將加工方法分為2大類,其中,WSYG、SXYG、MXYG和SXHG處理樣品劃分為第1類,此類樣品龍膽苦苷含量均在7.0%以上,顯著高于其他樣品,除前處理方法不同外,加工方法以陰干為主;WMSG、WSSG、SXSG、MXSG和WMYG處理樣品劃分為第2類,此類樣品龍膽苦苷含量低于6.5%,加工方法以曬干為主。

圖1 不同加工方法滇龍膽樣品聚類分析樹狀圖

2.5 主成分分析用SPSS 26.0對9種不同加工方法處理的36批(n=4)滇龍膽樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷含量進行主成分分析。由表6可知,以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn),得到2個主成分(PCA1和PCA2)。PCA1的特征值為1.779,其貢獻(xiàn)率最大,方差貢獻(xiàn)率為44.464%,由成分的載荷矩陣(表7)可知,龍膽苦苷在主成分1上的載荷值最高,對主成分1貢獻(xiàn)較大。PCA2的特征值為1.070,其總方差貢獻(xiàn)率為26.746%。前2個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到71.210%,表達(dá)全部信息的71.210%。

表6 主成分的特征根及貢獻(xiàn)率

表7 成分載荷矩陣

通過SPSS軟件處理后得出主成分得分系數(shù)(表8),第一主成分貢獻(xiàn)最大,其中第一主成分中系數(shù)最大的為龍膽苦苷,說明龍膽苦苷在滇龍膽的質(zhì)量控制中起著重要作用。根據(jù)主成分計算公式和主成分得分系數(shù)可以算出前2個主成分與4種有效成分的線性組合為:

表8 主成分得分系數(shù)

F1=0.588X1+ 0.502X2-0.164X3+0.058X4

F2=-0.175X1+0.113X2+0.759X3+0.500X4

計算主成分綜合得分及排序(表9)。由綜合得分可知,不同加工方法滇龍膽樣品中以水洗烘干(SXHG)綜合質(zhì)量最好;免洗陰干(MXYG)綜合質(zhì)量次之,但該方法加工的樣品總灰分和浸出物未達(dá)到《藥典》標(biāo)準(zhǔn);水洗陰干(SXYG)在傳統(tǒng)生產(chǎn)中農(nóng)戶廣泛使用,可根據(jù)天氣、場地等實際情況在產(chǎn)地加工中作為輔助干燥方法。

表9 不同加工方法滇龍膽藥材的主成分因子及品質(zhì)綜合評價

3 討論

中藥材經(jīng)產(chǎn)地加工后不僅便于藥材的運輸和儲藏,而且不同的產(chǎn)地加工方法對藥材品質(zhì)也有極大影響。中藥材產(chǎn)地初加工方法的選擇和形成通常是基于原產(chǎn)地習(xí)用方法、操作簡單、技術(shù)要求低、投入較少等原則[12],因此,該研究比較了9種不同產(chǎn)地初加工方法,通過綜合評價,結(jié)果表明不同產(chǎn)地初加工方法對滇龍膽藥材品質(zhì)有較大影響。傳統(tǒng)的免洗陰干和曬干雖然也能較好地保證藥材原有性狀,干燥成本低,但其耗時較久,所需干燥場地大,受天氣等因素影響較大,藥材容易發(fā)生霉變[22-23],而且未經(jīng)水洗的藥材總灰分、酸不溶性灰分較高,水溶性浸出物較低,未能達(dá)到《藥典》(2020版)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn),因此探索替代傳統(tǒng)干燥方法的新技術(shù)、新方法成為滇龍膽產(chǎn)地加工的重要任務(wù)。

該研究通過選取不同的滇龍膽初加工方法,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)滇龍膽經(jīng)水洗后新鮮藥材表面的灰塵和雜質(zhì)都大大減少,藥材的外觀形態(tài)和色澤較未洗過的更佳,并且總灰分、酸不溶性灰分和浸出物均能達(dá)到《藥典》標(biāo)準(zhǔn);從有效成分含量測定的結(jié)果可以看出,40 ℃烘干能較好地保留滇龍膽中的苷類成分,結(jié)合主成分綜合評價得分結(jié)果、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指標(biāo)比較,可知水洗后40 ℃烘干相對來說接近于傳統(tǒng)干燥方法,干燥后的樣品外觀性狀好,操作簡單,干燥時間短,并且所得樣品有效成分含量也較其他加工方法最高。

4 結(jié)論

綜上所述,滇龍膽新鮮藥材經(jīng)流水沖洗2 min,然后放入40 ℃烘箱烘干(即水洗烘干)是滇龍膽產(chǎn)地加工的適宜方法,若藥材加工量較大,可根據(jù)天氣、場地等實際情況采用水洗陰干方法進行加工。