高靜雷,楊彩紅,孫 蓉*,劉 姍

(1.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花 617000;2.攀枝花市林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,四川攀枝花 617000)

《中華人民共和國(guó)藥典》記載金龍膽草(ConyzabliniiH.Lév)具有清熱化痰、止咳平喘、解毒利濕、涼血止血作用,可用于治療肺熱咳嗽、痰多氣喘、咽痛等疾病[1]。與大多數(shù)中草藥相同,金龍膽草含有豐富的次生代謝物,包括萜類、黃酮類、揮發(fā)油及生物堿等,其中皂苷、苦蒿素和黃酮為其主要藥用成分[2]。早期臨床試驗(yàn)證明金龍膽草皂苷對(duì)治療慢性支氣管炎有一定療效且無明顯副作用[3-4]。齊永清等[5]研究表明金龍膽草總皂苷具有促進(jìn)呼吸道清除異物和抑制咳嗽的作用;此外金龍膽草皂苷對(duì)宮頸癌及肺癌細(xì)胞具有一定的抑制效果[6-7]?？噍锼厥窃摬菟幍奶卣骰衔?藥典要求金龍膽草干燥品苦蒿素含量不得少于0.30%,研究表明其可明顯地抑制幽門結(jié)扎大鼠胃潰瘍的形成[8];金龍膽草中的黃酮類物質(zhì)主要包括蘆丁、槲皮素、山奈酚、圣草素及它們的衍生物等[3,5,9],具有抗衰老、抗腫瘤、降血脂、抗病毒、止咳等作用。

金龍膽草藥材資源以野外生長(zhǎng)為主,由于環(huán)境的變化,目前該藥材資源正在日益減少,同時(shí)因其栽培周期較長(zhǎng)、易受病害侵襲、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高等,難以大規(guī)模人工種植,且次生代謝物在原植物中含量偏低,一系列原因致使該藥材的開發(fā)利用受限,難以滿足社會(huì)需求。提高次生代謝物含量、增加金龍膽草耐受性是改變現(xiàn)狀的重要舉措。外界環(huán)境因素(如干旱、低溫、高鹽、外源激素等)可通過激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,影響關(guān)鍵酶基因的表達(dá),從而合成和積累次生代謝產(chǎn)物,增加植物系統(tǒng)抗性,使植物產(chǎn)生脅迫耐受[10]。例如紫外光脅迫后轉(zhuǎn)MtIFS1基因的苜蓿(Medicagosativa)中出現(xiàn)了一個(gè)新的異黃酮化合物[11]。低溫脅迫24 h大豆(Glycinemax)根部總酚酸和異黃酮含量均增加[12]。徐茂軍[13]研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿的合成過程中,茉莉酸甲酯(MeJA)能夠調(diào)節(jié)長(zhǎng)春花堿的合成,以提高其含量。該研究通過紫外、干旱、高鹽、低溫和外源茉莉酸甲酯脅迫金龍膽草,檢測(cè)皂苷、苦蒿素和黃酮含量的變化,探討提高金龍膽草次生代謝物含量的有效手段,為培育高含量、高脅迫耐受金龍膽草植株提供基礎(chǔ)材料,也為金龍膽草藥物的應(yīng)用提供資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料金龍膽草植株2020年夏通過種子盆栽于攀枝花學(xué)院溫室,經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳惠教授鑒定為金龍膽草(ConyzabliniiH.Lév)。待植株長(zhǎng)至蕾薹期后將其分為5組,每組9盆進(jìn)行脅迫試驗(yàn),在上、中、下部位各隨機(jī)選取葉片進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1鹽脅迫處理。取長(zhǎng)勢(shì)一致蕾薹期金龍膽草植株進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn),鹽脅迫濃度為200 mmol/L,鹽脅迫時(shí)間為0(CK)、24和48 h,培養(yǎng)溫度為室溫,光照為正常日光,每個(gè)次生代謝物組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理0、24和48 h分別取一次樣,取樣時(shí)間在09:00—10:00。取完每個(gè)樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測(cè)定。

1.2.2低溫脅迫處理。低溫脅迫試驗(yàn)脅迫溫度為4 ℃,脅迫時(shí)間為0 (CK)、24和48 h,光照為正常日光,正常澆水,每個(gè)次生代謝物組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理0、24和48 h分別取一次樣,取樣時(shí)間在09:00—10:00。取完每個(gè)樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測(cè)定。

1.2.3干旱脅迫處理。采用盆栽控水法,自然干旱的方式進(jìn)行干旱脅迫處理,在處理前,所有材料均充分灌溉,并采樣作為對(duì)照(0 d),之后分別在10和15 d取一次樣,培養(yǎng)溫度為室溫,光照為正常日光,每個(gè)次生代謝物組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)間在09:00—10:00。取完每個(gè)樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測(cè)定。

1.2.4紫外脅迫處理。將試驗(yàn)材料放置于垂直距離為45 cm的40 W紫外燈下,脅迫時(shí)間為0(CK)、24和48 h,培養(yǎng)溫度為室溫,正常澆水,每個(gè)次生代謝物組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)間在09:00—10:00。取完每個(gè)樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測(cè)定。

1.2.5茉莉酸甲酯處理。用100 μmol/L茉莉酸甲酯-0.25%乙醇溶液每隔2 h噴施葉面一次,分別于噴施前0 h(CK)和噴施后24、48 h取樣,培養(yǎng)溫度為室溫,光照為正常日光,每個(gè)次生代謝物組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)間在09:00—10:00。取完每個(gè)樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測(cè)定。

1.3 含量測(cè)定方法

1.3.1皂苷含量測(cè)定。采用乙醇超聲提取法提取皂苷,取樣品粉末0.1 g加入10 mL 70%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超聲波提取40 min,提取后的溶液12 000 r/min離心5 min,取上清于干凈試管中,在烘箱揮干至恒重,加入0.3 mL 5%香草醛溶液(用冰醋酸配制)、0.8 mL高氯酸,65 ℃水浴25 min,取出用冷水終止反應(yīng),隨即加入5 mL冰醋酸,搖勻備用,在544 nm 處測(cè)定吸光度,按公式(1)計(jì)算含量。

(1)

式中:c為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的儀器檢測(cè)濃度(mg/mL);V1為提取液定容量(mL);V2為測(cè)定時(shí)定容量(mL);M為稱取藥材量(g)。

取3 mg齊墩果酸用70%乙醇定容至10 mL,分別取0、100、200、300、400、500 μL溶液,通過上述方法測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2苦蒿素含量測(cè)定。采用甲醇浸提法提取苦蒿素,取樣品粉末0.1 g加入4 mL甲醇37 ℃浸提過夜,12 000 r/min離心10 min,取上清液,利用0.22 μm有機(jī)相濾頭過濾,將濾液裝入液相樣品瓶中,通過高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)苦蒿素含量。

HPLC條件:以安捷倫C18柱(150 mm×4.5 mm×5 μm)為色譜柱,柱溫25 ℃,流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙腈=40∶45∶5,進(jìn)樣量為10 μL,流速為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L。

1.3.3黃酮含量測(cè)定。采用乙醇超聲提取法提取黃酮,取樣品粉末0.1 g加入3 mL 65%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超聲波提取30 min,抽濾取濾液。再在濾渣中加入3 mL 65%乙醇,重復(fù)上述操作,合并濾液。加入6 mL石油醚過夜浸提,使用分液漏斗分離并收集下層液體,通過0.45 μm有機(jī)相濾頭過濾,取濾液進(jìn)行含量測(cè)定。取1 mL濾液于25 mL燒杯中,依次加入0.5 mL 5% NaNO2,放置6 min;加入0.5 mL 10% Al(NO)3,放置6 min;加入4 mL 10% NaOH溶液,最后用65%乙醇定容至10 mL,室溫下反應(yīng)15 min。在510 nm處測(cè)定吸光度,按公式(2)計(jì)算含量。

(2)

式中:c為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的儀器檢測(cè)濃度(mg/mL);V1為提取液定容量(mL);V2為測(cè)定時(shí)定容量(mL);V3為吸取測(cè)定量(mL);M為稱取藥材量(g)。

取25 mg蘆丁用65%乙醇定容至25 mL,分別取0、200、400、600、800、1 000 μL溶液,通過上述方法測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同非生物脅迫處理進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),獲得最優(yōu)處理方式。計(jì)算公式如下:

隸屬函數(shù)值:

U(Xij)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

反隸屬函數(shù)值:

U(Xij)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

式中:U(Xij)為i處理j代謝物含量的隸屬函數(shù)值;Xij為i處理j代謝物含量的測(cè)定值;Xmin、Xmax為所有處理中某一代謝物含量的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫對(duì)金龍膽草皂苷含量的影響從圖1可以看出,經(jīng)過不同脅迫處理后金龍膽草皂苷含量均呈上升趨勢(shì),其中紫外脅迫后含量上升最明顯,在脅迫24 h是對(duì)照(CK)的1.36倍,48 h是CK的2.06倍。其次為低溫脅迫,脅迫24和48 h皂苷含量分別為CK的1.34和2.05倍。再者為茉莉酸甲酯處理,脅迫24和48 h皂苷含量分別為CK的1.29和1.69倍。干旱脅迫和高鹽脅迫作用不明顯,干旱處理10 d皂苷含量增加了1.18倍,15 d增加了1.21倍,而高鹽處理24 h是CK的1.05倍,48 h是CK的1.34倍。因此不同處理對(duì)金龍膽草皂苷含量的影響從大到小依次為紫外>低溫>茉莉酸甲酯>高鹽>干旱。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同脅迫對(duì)金龍膽草苦蒿素含量的影響從圖2可以看出,對(duì)苦蒿素含量影響最大的處理也為紫外脅迫,與CK相比,脅迫24 h苦蒿素含量增加了0.23倍,48 h增加了0.43倍。其次為高鹽脅迫,脅迫24 h苦蒿素含量增加了0.04倍,48 h增加了0.27倍。低溫脅迫與高鹽脅迫對(duì)苦蒿素含量的影響相差不大,脅迫48 h苦蒿素含量增加了0.26倍。再者為茉莉酸甲酯處理,與CK相比,處理24 h苦蒿素含量增加了0.11倍,48 h增加了0.19倍。影響最小的脅迫為干旱,干旱脅迫10 d苦蒿素含量?jī)H增加了0.03倍,15 d增加了0.06倍。因此不同處理對(duì)金龍膽草苦蒿素含量的影響從大到小依次為紫外>高鹽>低溫>茉莉酸甲酯>干旱。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同脅迫對(duì)金龍膽草黃酮含量的影響從圖3可以看出,各非生物脅迫對(duì)黃酮含量的影響均呈升高趨勢(shì),其中茉莉酸甲酯處理作用最明顯,處理24 h黃酮含量增加了2.95倍,48 h增加了3.68倍。干旱脅迫10 d黃酮含量增加了1.04倍,15 d增加了3.33倍。低溫脅迫僅次于干旱脅迫,脅迫48 h金龍膽草黃酮含量增加了3.02倍。高鹽和紫外脅迫對(duì)黃酮含量的影響較小,脅迫24 h黃酮含量分別增加了1.27和1.21倍,48 h黃酮含量分別增加了1.33和1.85倍。因此不同處理對(duì)金龍膽草黃酮含量的影響從大到小依次為茉莉酸甲酯>干旱>低溫>紫外>高鹽。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同非生物脅迫下金龍膽草主要化合物含量隸屬函數(shù)分析選擇各脅迫處理48 h/15 d的次生代謝物含量數(shù)據(jù),利用模糊隸屬函數(shù),計(jì)算各脅迫綜合隸屬值。根據(jù)隸屬函數(shù)平均值的大小確定最優(yōu)脅迫方式。由表1可知,各脅迫處理的效果由強(qiáng)到弱依次為紫外>茉莉酸甲酯>低溫>高鹽>干旱。

表1 不同非生物脅迫下次生代謝物含量隸屬函數(shù)值

3 結(jié)論與討論

研究表明藥用植物的藥理作用主要與次生代謝物有關(guān),且當(dāng)其受到環(huán)境脅迫時(shí)可通過積累次生代謝物提高自我保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)能力。因此研究其與環(huán)境的關(guān)系,對(duì)藥用植株栽培過程中控制有關(guān)成分的合成和積累具有指導(dǎo)意義。皂苷、苦蒿素、黃酮為藥用植物金龍膽草的主要有效成分,提高它們的含量可獲得高品質(zhì)的金龍膽草藥材。次生代謝物的積累需要環(huán)境因子的誘導(dǎo),可誘導(dǎo)或影響次生代謝產(chǎn)物合成積累的環(huán)境因子很多,例如個(gè)體密度和病蟲害的侵襲等生物因子,以及水分、溫度、紫外線、外源激素、土壤理化性質(zhì)等非生物因子[14-15]。各類非生物因子通過激活信號(hào)分子,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)一系列關(guān)鍵酶基因的表達(dá),最終調(diào)節(jié)次生代謝物的合成。

基于此,該研究探討了鹽脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫、紫外脅迫及外源激素誘導(dǎo)對(duì)皂苷、苦蒿素、黃酮含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各類脅迫下,3種次生代謝物含量均呈增加趨勢(shì)。其中紫外脅迫對(duì)金龍膽草皂苷和苦蒿素的作用最大,兩者皆為萜類衍生物。Zhan等[16]研究表明,在紫外脅迫下金龍膽草抗氧化能力提高,同時(shí)部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表現(xiàn)為上調(diào),這些條件有利于苦蒿素的積累。黨悅方[17]研究UV-B輻射對(duì)夏枯草成分含量的影響,結(jié)果表明,UV-B對(duì)齊墩果酸和熊果酸的含量均有促進(jìn)作用。該研究表明對(duì)黃酮含量影響最明顯的是茉莉酸甲酯處理,雒曉鵬等[18]和王旭云等[19]均研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯對(duì)植物黃酮含量有明顯促進(jìn)作用。

綜上所述,非生物脅迫對(duì)金龍膽草次生代謝物含量有促進(jìn)作用,可以利用適當(dāng)?shù)拿{迫手段獲得高次生代謝物含量的金龍膽草植株,為高品質(zhì)金龍膽草的培育提供一定的參考,對(duì)金龍膽草藥物的開發(fā)具有促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上,未來可對(duì)其脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)一步研究,獲得關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和酶基因,調(diào)控次生代謝物的合成。