丁淑荃,吳夢曉,尤 昆,袁 娟,崔鑫炎,黃 梅,謝俊杰,米 笛

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽合肥 230000;2.肥東縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站,安徽合肥 231600 ;3.定遠(yuǎn)縣綠色親情種養(yǎng)殖專業(yè)合作社,安徽滁州 233200)

中華鱉(Pelodiscussinensis)因其蛋白質(zhì)含量豐富,藥用價(jià)值高,成為我國經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高,養(yǎng)殖規(guī)模最大的龜鱉類,2021年鱉類的養(yǎng)殖總產(chǎn)量可達(dá)364 878 t[1]。我國中華鱉種質(zhì)資源豐富,但缺乏有效的亞種分化,常把不同地理種群的名作為中華鱉的同物異名;盡管在分類學(xué)中它們同屬于中華鱉,但不同水系和地理居群的品系之間存在巨大的生理和性狀差異。具有良好經(jīng)濟(jì)性狀的各品系鱉可以為種質(zhì)研究和良種選育提供豐富的選擇性培養(yǎng)材料。但近年來外來鱉種的引進(jìn)以及持續(xù)近交繁殖,導(dǎo)致中華鱉品種純度下降與質(zhì)量下滑,降低了種質(zhì)間遺傳多樣性[2]。目前,種質(zhì)資源的嚴(yán)重退化已成為我國中華鱉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大障礙,因此現(xiàn)有中華鱉種質(zhì)資源的遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)分析工作迫在眉睫。

此前,中華鱉?；谛螒B(tài)學(xué)進(jìn)行分類,由于性狀受發(fā)育階段和環(huán)境因素的影響,僅顯示有限的變異,因此難以固定具體性狀并得到穩(wěn)定的良種資源[3]。近年來,分子標(biāo)記技術(shù)作為種群遺傳和系統(tǒng)發(fā)育研究中的有效手段,已成為遺傳多樣性評估中的重要方法,不僅有助于研究種群結(jié)構(gòu)、分類問題,還能幫助種質(zhì)鑒定,確定種質(zhì)保護(hù)的優(yōu)先級[4]。分子標(biāo)記技術(shù)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ),主要包括簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)、簡單重復(fù)序列(SSR)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)[5]。ISSR作為一種基于SSR基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究[6]。譚舜等[7]建立了紅尾仙女蝦ISSR的反應(yīng)體系。ISSR分析表明,崇明白山羊的公羊具備更高的遺傳水平[8];丹東和秦皇島松江鱸魚群體分化程度較低[9];分布于廣東從化的平胸龜在物種水平和居群水平的遺傳多樣性水平均要高于福建壽寧地區(qū)[10]。與SSR標(biāo)記相比,ISSR不需要基因組序列,更加省時(shí)且經(jīng)濟(jì)。與RAPD和RFLP相比,ISSR除了可評估密切相關(guān)的個體之間的遺傳多樣性之外,還具備可靠性、多態(tài)性高、成本低及高效等特性[11-12]。

遺傳多樣性和變異性是生物對環(huán)境變化作出適應(yīng)性反應(yīng)的基礎(chǔ),擁有足夠豐富的遺傳多樣性的物種在應(yīng)對不斷變化的環(huán)境和競爭者時(shí)具有更大的優(yōu)勢[13]。因此,對中華鱉種群遺傳多樣性以及種內(nèi)、種間、種群結(jié)構(gòu)的研究,為中華鱉種質(zhì)資源保護(hù)提供一定的研究基礎(chǔ),并為新品種選育改良提供數(shù)據(jù)參考。分子標(biāo)記技術(shù)以其先進(jìn)的計(jì)算方法從基因?qū)用鏋榉治鲞z傳多樣性和了解種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了新的切入點(diǎn)。筆者利用ISSR技術(shù)對4個地方品系以及1個雜交品系的中華鱉進(jìn)行分子標(biāo)記,評估了不同品系中華鱉遺傳多樣性、各種群間親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu),為輔助現(xiàn)有中華鱉品種選育、品種分類以及品種表征鑒定等提供基礎(chǔ)資料,同時(shí)為中華鱉遺傳資源的有效評價(jià)和利用提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)中華鱉來自5個不同居群,均由安徽省滁州市定遠(yuǎn)縣綠色親情種養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供,具體特征和信息見表1?；铙w中華鱉運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3 d后取樣。紗布擦拭體表,并用乙醇體表消毒后取腿部肌肉,液氮冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中華鱉5個供試居群的基礎(chǔ)信息

1.2 DNA的提取及檢測采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取肌肉組織基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度,超微量分光光度計(jì)檢測核酸濃度,所提取DNA的OD260/OD280為1.70～1.94,完整度良好。

1.3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測所用引物序列來源于加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第九套ISSR引物序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。篩選出10對多態(tài)性高、擴(kuò)增條帶清晰的ISSR引物用于擴(kuò)增(表2)。反應(yīng)體系為20 μL:cDNA 2.0 μL,2×RapidTaqMaster Mix 10.0 μL,引物(10 μmol/L)0.8 μL,ddH2O 7.2 μL,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃徹底延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠150 V電泳1 h,置于紫外凝膠成像儀中拍照保存后進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)與分析。

表2 ISSR引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析由于ISSR為顯性標(biāo)記,同一引物下PCR產(chǎn)物電泳遷移率一致的條帶代表1個等位基因位點(diǎn)。根據(jù)同一位點(diǎn)條帶的有無記錄電泳結(jié)果,有帶的記為1,無帶的記為0,將所得數(shù)據(jù)輸入Excel表格構(gòu)建0/1矩陣。統(tǒng)計(jì)總條帶數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù),計(jì)算多態(tài)性條帶(PPB)比例。用Popgen 32軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)性位點(diǎn)(PPL)比例、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、居群總遺傳多樣性指數(shù)(Ht)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、居群總遺傳多樣性指數(shù)(Ht)、居群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)。用GenAlEx 6.5軟件計(jì)算遺傳一致度、遺傳距離,并進(jìn)行分子方差(AMOVA)分析。用NTSYSpc 2.10e軟件以及MEGA軟件構(gòu)建非加權(quán)組平均法(UPGMA)品種間聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性用篩選出的10條引物對65個中華鱉樣本進(jìn)行PCR,擴(kuò)增結(jié)果見表2。共獲得123條清晰可見的條帶,其中92條條帶具有多態(tài)性,平均多態(tài)性條帶(PPB)比例為73.417%,每條引物平均擴(kuò)增出的條帶數(shù)為12.3條,多態(tài)性條帶數(shù)為5～15條。引物多態(tài)性條帶比例為50.00%～93.75%。其中引物UBC854多態(tài)性條帶比例高達(dá)93.75%。圖1為用引物UBC807擴(kuò)增的電泳條帶。

注:Z.雜交鱉;W.烏鱉品系;R.日本品系;T.中國臺灣品系;H.淮河品系;M.Marker,DL 2 000。

2.2 遺傳多樣性5個居群中華鱉的遺傳多樣性參數(shù)見表3。中華鱉5個居群的等位基因數(shù)(Na)為1.748 0,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.417 7,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.245 5,Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.370 4,多態(tài)性位點(diǎn)(PPL)比例為74.80%。在中華鱉5個居群中,烏鱉群體的遺傳多樣性水平要高于其他中華鱉群體,Na為1.536 6,Ne為1.374 3,H為0.207 5,I為0.302 5,PPB為66,PPL為53.66%?；春喻M居群的變異程度最小(Na=1.365 9,Ne=1.247 5,H=0.139 2,I=0.204 9,PPB=45,PPL=36.59%)。

表3 中華鱉5個居群的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 居群遺傳分化根據(jù)Popgen 32的計(jì)算結(jié)果,居群總遺傳多樣性指數(shù)(Ht)=0.240 0±0.037 1,居群內(nèi)遺傳多樣性指數(shù)(Hs)=0.174 7±0.021 6,基因分化系數(shù)(Gst)=0.271 9,基因流(Nm)=1.339 0。說明有27.19%的遺傳變異出現(xiàn)在居群間,有72.81%的遺傳變異出現(xiàn)在居群內(nèi)。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果與上述Popgen計(jì)算結(jié)果一致,結(jié)果見表4。這說明中華鱉的遺傳多樣性主要分布在居群內(nèi),各居群間表現(xiàn)出一定的遺傳分化水平。

表4 中華鱉5個居群的AMOVA分析

2.4 親緣關(guān)系及聚類結(jié)果由表5可知,5個居群的遺傳一致度為0.880 3～0.937 1,均值為0.910 1,雜交鱉與日本品系遺傳一致度最高;5個品系遺傳距離均值為0.943 7,雜交鱉與日本品系之間的遺傳距離最小(0.064 9),中國臺灣品系和烏鱉品系的遺傳距離最大(0.127 5)。從圖2可以看出,5個地理居群的中華鱉遺傳系數(shù)為0.89～0.94,在相似系數(shù)為0.89時(shí),分為2個類群,在相似系數(shù)為0.93時(shí),可分為3個類群,雜交鱉、日本品系和淮河品系聚為一類群,其中,雜交鱉與日本品系的相似系數(shù)最高,可達(dá)到達(dá)0.94。烏鱉單獨(dú)為一類群,可見烏鱉品系與其他品系的差異較大。

圖2 中華鱉5個居群的聚類分析圖

表5 中華鱉5個居群間的遺傳一致度(對角線上面)和遺傳距離(對角線下面)

3 討論

中華鱉群體的準(zhǔn)確區(qū)分一直是育種工作的重點(diǎn)與難點(diǎn),前人通過對不同品系中華鱉的表型特征進(jìn)行區(qū)分,建立的判別函數(shù)可以作為品系區(qū)別的重要依據(jù)。陸文浩等[18]通過多元統(tǒng)計(jì)分析建立了判別方程,其中洪澤湖和太湖群體判別準(zhǔn)確率可達(dá)100%,長江口群體的判別準(zhǔn)確率達(dá)93.3%。聚類分析表明,長江口群體與太湖群體親緣關(guān)系很近,洪澤湖群體與它們的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。當(dāng)品系表型區(qū)別較大,地理差距較遠(yuǎn)時(shí),通過成分分析統(tǒng)計(jì)通常能得到較高的判別率。但當(dāng)親緣關(guān)系越近,或者品系過多、群體形態(tài)相似度很高時(shí),傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析方法通常難以獲得較高的判別準(zhǔn)確率。梁宏偉等[19]建立了中華鱉3個品系的判別函數(shù),淮河品系、黃河品系和日本品系的判別準(zhǔn)確率分別為91.7%、75.0%和73.8%。李思發(fā)等[14]對中華鱉7個養(yǎng)殖群體的判別分類的準(zhǔn)確率以黃河鱉群最高(73%),淮河鱉群和太湖鱉群較差(分別為45%、44%);聚類分析顯示,在親緣關(guān)系上太湖鱉與崇明鱉較近,黃河鱉和淮河鱉較近,洞庭湖鱉和雜交鱉較近。這表明僅通過分析體形和體表差異進(jìn)行的比較研究難以保證高的判別準(zhǔn)確率。

相比于傳統(tǒng)的表型特征成分分析,分子標(biāo)記不依賴于動物的表型特征,而是根據(jù)遺傳信息進(jìn)行區(qū)分,即使面對多個表型極其相似的品種也可以很好地將其區(qū)分開來。對中華鱉線粒體DNA中SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型和區(qū)分,共檢測到7個SNPs,可用于鑒定太湖品系、日本品系、中國臺灣品系和黃河品系[20]。Zhang等[21]對中華鱉的線粒體基因進(jìn)行了擴(kuò)增和酶切,建立了太湖、中國臺灣、日本和黃河4個品系中國鱉的PCR-RFLP鑒定方法。在該試驗(yàn)中,雜交鱉為日本鱉和江西鱉的后代,外形最為相似,而烏鱉全身烏黑,表型與其他品系相差甚遠(yuǎn);聚類分析結(jié)果也表明,日本品系與雜交鱉親緣關(guān)系最近,烏鱉與其他鱉親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同時(shí)個體系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果與聚類分析保持一致,且5個品系的65個個體的中華鱉都得到了準(zhǔn)確區(qū)分,因此,使用ISSR的分析參數(shù)及試驗(yàn)方法對于區(qū)分中華鱉品系有高度準(zhǔn)確率。

除此之外,分子標(biāo)記還可獲得更多的物種遺傳參數(shù),可以反映遺傳特征、種群分化和物種間的進(jìn)化關(guān)系。遺傳多樣性是生物多樣性的基本來源以及自然選擇進(jìn)化的原材料,常被用來量化種群內(nèi)遺傳變異性大小[13]。Xie等[22]利用RAD-seq開發(fā)中華鱉SNP標(biāo)記,共鑒定了105個高質(zhì)量的SNP標(biāo)記。群體遺傳統(tǒng)計(jì)顯示,觀察雜合度(Ho)和期望雜合度值(He)分別為0.114 3～0.676 5和0.107 8～0.447 7。該試驗(yàn)中5個群體He為0.139 2～0.207 4。He越高,反映群體的遺傳一致性就越低,其遺傳多樣性就越豐富。該試驗(yàn)中5個居群中,烏鱉遺傳多樣性參數(shù)最高,且由聚類結(jié)果可知,烏鱉品系與其他4個品系的親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)。這表明烏鱉不僅形成了區(qū)別與其他品系的中華鱉穩(wěn)定群體,還具備變異獲得更多優(yōu)良性狀的可能?；春喻M居群的變異程度最小,淮河鱉作為我國淮河流域的一支中華鱉地理種群,其純合體較為稀少,遺傳多樣性處于較低水平的原因可能是養(yǎng)殖場累代人工選育、近親繁殖的結(jié)果。另外,雜交中華鱉的遺傳特性和經(jīng)濟(jì)性狀有著更加顯著的生長活力,與親本相比,雜交鱉的特異等位基因數(shù)和多態(tài)片段數(shù)增加[23],表明雜交增加了中華鱉的遺傳多樣性。

該研究中基因分化系數(shù)(Gst)=0.271 9,表明群體間存在高等的遺傳分化,分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明,有27%遺傳變異出現(xiàn)在居群,73%變異發(fā)生在居群內(nèi)部,這說明該研究中華鱉群體間差異不及群體內(nèi)差異,同一群體內(nèi)的差異過大,遺傳多樣性高,性狀難以固定。Bu等[24]對3個地理種群(蕪湖、安徽大別山、山東聊城)的遺傳變異分析也表明,中華鱉的變異主要發(fā)生在居群內(nèi)(97.4%),而不是種群間(2.6%)?；蛄?Nm)是指不同種群之間基因交流的過程中,一個等位基因從一個種群進(jìn)入到另一個種群,可發(fā)生在同種或不同種的生物種群之間,是維持種群內(nèi)遺傳同質(zhì)性和消除種群間遺傳分化的重要途徑。Feller[25]研究認(rèn)為,Nm>1時(shí),主要發(fā)揮均質(zhì)化作用,即從其他種群流入的基因會阻止種群間的局部分化,該試驗(yàn)中Nm為1.339 0,這可能也是中華鱉遺傳分化程度較低的原因之一。由于養(yǎng)鱉業(yè)的快速發(fā)展,養(yǎng)殖戶對各品系的雜交造成了中華鱉基因的混雜,頻繁的基因流和均質(zhì)化作用使得種群間的遺傳分化程度低,該結(jié)論與AMOVA分析一致。

綜上所述,該試驗(yàn)可以根據(jù)所篩選的ISSR引物以及遺傳參數(shù)分析區(qū)分5個中華鱉種群,其中烏鱉遺傳多樣性最高,雜交鱉和日本鱉親緣關(guān)系最近,群體總體的遺傳參數(shù)較為豐富,但同時(shí)也迫切需要采取保護(hù)措施來維持不同種群的遺傳穩(wěn)定性。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究中華鱉的保護(hù)生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析提供了基本的遺傳資料,與形態(tài)鑒定相比,大大提高了對不同品系中華鱉的鑒別能力,為中華鱉的鑒定和指導(dǎo)中華鱉的選育提供了進(jìn)一步技術(shù)支持。