江海儀，李婉瑩，高煥，2，3*

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014）

肝胰腺微孢子蟲?。╤epatopancreatic microsporidiosis, HPM），由蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）侵染蝦類的肝胰腺引起[1]。2004 年最早在泰國斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的肝胰腺中[1]發(fā)現(xiàn)EHP，2009 年經(jīng)組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)分析，被成功分離并命名為EHP。多種重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類會(huì)被EHP 侵染，如凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）等[2]，感染后的個(gè)體生長(zhǎng)速度遲緩[1]。盡管在早期研究中觀察到EHP流行率和感染程度較低[1]，但EHP 引起的HPM，仍在一些亞洲國家（包括泰國、印度、越南、馬來西亞、印度尼西亞和中國等）蝦類養(yǎng)殖業(yè)中蔓延，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在對(duì)蝦的研究中還發(fā)現(xiàn)另一種微孢子蟲——對(duì)蝦八疊胞蟲（Agmasoma penaei），它主要感染機(jī)體的結(jié)締組織和肌肉，會(huì)導(dǎo)致蝦的肌肉呈乳白色，肌肉纖維退化[1-8]。而嚴(yán)重感染EHP 的脊尾白蝦肌肉也會(huì)發(fā)白，但是主要被侵染組織為肝胰腺和腸道，主要臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度緩慢，可以正常攝食，通常出現(xiàn)軟殼、嗜睡、攝食量減少和中腸空虛等現(xiàn)象[9-10]。嚴(yán)重感染EHP 的蝦類，肝胰腺出現(xiàn)萎縮，可能會(huì)因感染其他細(xì)菌或病毒導(dǎo)致死亡[11-12]。有研究表明，感染EHP 的蝦，感染急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）和膿毒性肝胰腺壞死（SHPN）的概率上升[13]。被感染蝦的肝小管上皮細(xì)胞脫落明顯，在管腔中觀察到大量的孢子聚集[1]，腸道菌群結(jié)構(gòu)被破壞[14]，蝦腸道微生物區(qū)系、細(xì)菌介導(dǎo)功能、消化和免疫活動(dòng)發(fā)生改變，蝦的生長(zhǎng)機(jī)能受到抑制[15]。由于EHP 具有由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的胞壁，目前各種治療手段效果均欠佳，主要側(cè)重研究預(yù)防方法[1]。

1 EHP 生物學(xué)特性

EHP 歸類于真菌界、微孢子蟲門[16]，與分支在真菌界的隱真菌門是姊妹門[17]。EHP 基本結(jié)構(gòu)包括高電子密度外壁、低電子密度內(nèi)壁、原生質(zhì)膜組成的胞壁、錨定盤[16]、胞原質(zhì)、細(xì)胞核[16]、極膜層以及特殊的侵染裝置——極管等[16]。成熟EHP 孢子在光學(xué)顯微鏡鏡下呈直徑為（0.7±1.1）μm 的橢圓形[16]，孢子頂端的錨定盤與極管相連接[7]。EHP 孢子在細(xì)胞膜周圍有一層厚厚的保護(hù)性幾丁質(zhì)壁，使它們能夠在宿主外存活并參與微孢子蟲的發(fā)病機(jī)制[18]。

EHP 生活史可劃分為3 個(gè)階段，包括宿主體外的感染期、宿主細(xì)胞內(nèi)的裂增殖期和孢子增殖期，與之對(duì)應(yīng)的是孢子、母孢子與孢子母細(xì)胞[3]。因?yàn)槌墒斓腅HP 孢子是EHP 在宿主細(xì)胞外的載體[16]，所以在宿主體外成熟孢子通過彈出極管，釋放孢原質(zhì)，讓孢原質(zhì)（孢子）通過被刺穿的細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)[3]。在宿主細(xì)胞入侵過程中，環(huán)境刺激讓孢子萌發(fā)，通過外翻釋放極管，孢原質(zhì)通過極管轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，孢原在此發(fā)育并完成生命周期[19]。Aldama-Cano 等[20]利用Phloxin B 染色，發(fā)現(xiàn)可通過擠壓其極管來測(cè)量純化的EHP 孢子的活性。Jaroenlak 等[21]鑒定了EHP 的第一個(gè)孢壁蛋白（EhSWP1），發(fā)現(xiàn)EhSWP1 定位于孢子內(nèi)壁和外壁，能夠利用其N 端的3 個(gè)肝素結(jié)合基序（HBMs），在感染過程中參與了孢子與宿主細(xì)胞表面肝素（一種氨基葡聚糖）的連接。裂增殖期是一個(gè)非傳染性階段，孢原質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞后與細(xì)胞質(zhì)直接接觸，孢子通過截取宿主營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行核分裂，發(fā)育成熟后成為裂殖體并發(fā)生變異，當(dāng)變異的母孢子積累到一定程度，便進(jìn)入孢子增殖期[3]。這一時(shí)期代表了EHP的增殖期，在宿主細(xì)胞中有多核的細(xì)胞質(zhì)，含有許多細(xì)胞核[16]。孢子增殖期是宿主細(xì)胞的多細(xì)胞階段，該時(shí)期宿主的肝胰腺被感染，肝小管上皮細(xì)胞破裂[1]，釋放的成熟孢子可以感染自身其他肝小管細(xì)胞或通過糞便進(jìn)入水體環(huán)境中感染其他蝦[1]。

2 流行與傳播途徑

EHP 于2013 年在我國被檢出，其引發(fā)的對(duì)蝦HPM 在我國主要對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)流行。如2015 年浙江省接近四分之一（23.1%）的凡納濱對(duì)蝦蝦苗攜帶EHP[22]；同年遼寧省三分之一以上（34.6%）的凡納濱對(duì)蝦病蝦中都能檢測(cè)到EHP[23]；2015—2016 年江蘇如東地區(qū)因養(yǎng)殖對(duì)蝦感染EHP，生長(zhǎng)受影響，導(dǎo)致產(chǎn)量下降15%～30%[24]。除了在我國眾多省市被檢出，EHP 在泰國、越南、印度等國家亦被發(fā)現(xiàn)。在泰國，由EHP 引起的對(duì)蝦肝胰腺微孢子蟲病與對(duì)蝦白斑綜合征、急性肝胰腺壞死病，共同成為對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重大問題，對(duì)養(yǎng)殖區(qū)造成了巨大影響[25]。

EHP 可以通過攝食被EHP 污染的飼料、餌料、病蝦殘?bào)w以含有成熟孢子的養(yǎng)殖水體進(jìn)行水平傳播，也可以由母代宿主傳遞給子代宿主進(jìn)行垂直傳播[12]。Salachan 等[26]將感染EHP 的對(duì)蝦和健康蝦混合養(yǎng)殖，導(dǎo)致EHP 侵染健康蝦；而Pattarayingsakul 等[27]通過對(duì)養(yǎng)殖感染EHP 對(duì)蝦的水體進(jìn)行孢子活性檢測(cè)，并用養(yǎng)殖過病蝦的水體養(yǎng)殖健康凡納濱對(duì)蝦，證明EHP 可以進(jìn)行水平傳播。在其他的微孢子蟲研究中，會(huì)用其存在于宿主的性腺組織，證明這些微孢子蟲可垂直傳播[28]。但原位雜交（ISH）試驗(yàn)檢測(cè)感染EHP 的幼蝦和親蝦的性腺、肝胰腺組織，發(fā)現(xiàn)性腺組織中沒有EHP 陽性信號(hào)[29]，而肝胰腺中出現(xiàn)陽性信號(hào)[29]。該研究沒有檢測(cè)各個(gè)生命階段的蝦，且取樣數(shù)量有限，并不能證明EHP 無法實(shí)現(xiàn)垂直傳播[30]。文獻(xiàn)[30]研究發(fā)現(xiàn)，被投喂病蝦組織的凡納濱對(duì)蝦親蝦，其孵化池中的無節(jié)幼體會(huì)被EHP 侵染，這可能是通過水平傳播給孵化場(chǎng)中的后代，因?yàn)樘幱贜6 階段的無節(jié)幼體，以浮游生物為食，此時(shí)會(huì)受到侵染[29]。程?hào)|遠(yuǎn)[31]對(duì)中國4 個(gè)不同地區(qū)的凡納濱對(duì)蝦群體進(jìn)行對(duì)蝦生長(zhǎng)參數(shù)測(cè)量，并檢測(cè)各群體對(duì)蝦的肝胰腺組織中的EHP 感染載量，發(fā)現(xiàn)群體樣本數(shù)和EHP 對(duì)數(shù)因地區(qū)不同而存在差異，認(rèn)為EHP 的傳播方式因群體而異。

3 病理癥狀

蝦肝腸胞蟲不會(huì)在蝦體外部造成可見的跡象，但它確實(shí)減緩了其生長(zhǎng)速度[16]。飼料系數(shù)的下降也是感染EHP 對(duì)蝦的臨床癥狀[32]。此外，感染EHP 的對(duì)蝦容易受到繼發(fā)性細(xì)菌和病毒感染[33]。自2003 年以來，在泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)了EHP，感染的對(duì)蝦表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢綜合征（MSGS），并與斑節(jié)桿菌病毒（MBV）、肝胰腺細(xì)小病毒（HPV）和弧菌等條件病原體混合感染[34]。膿毒性肝胰腺壞死（SHPN）和EHP病例之間的密切關(guān)聯(lián)表明，EHP 增加了蝦對(duì)弧菌的易感性[35]，因?yàn)镋HP 感染會(huì)破壞肝胰管細(xì)胞，使弧菌可以定殖在脫落的細(xì)胞和暴露的基底膜。

文獻(xiàn)[1，36-37]研究發(fā)現(xiàn)，染病蝦肝胰腺組織中有EHP 孢囊和被染成妃紅色的孢子，同時(shí)肝小管上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同生命階段的EHP，感染嚴(yán)重的上皮細(xì)胞會(huì)裂解或脫落。利用被EHP 感染蝦的肝胰腺組織制作濕涂片，通過Phloxin B 染色可觀察到EHP 孢子[20]。感染EHP 的蝦肝胰腺會(huì)萎縮，腸道產(chǎn)生炎癥[25，38]，個(gè)別病蝦可排白便[1]。但對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究發(fā)現(xiàn)，白便綜合征（WFS）與EHP 沒有因果關(guān)聯(lián)[6]，因?yàn)樵?jīng)產(chǎn)生白色糞便的凡納濱對(duì)蝦池塘，即使停止產(chǎn)生白色糞便，池塘仍然可以檢測(cè)出EHP[39]。肝胰腺和腸道是蝦類重要的營養(yǎng)吸收和免疫器官，而腸道的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性與宿主健康密切相關(guān)[39]。EHP 作為專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，高度依賴宿主，利用宿主細(xì)胞質(zhì)中豐富的環(huán)境和擴(kuò)展的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白庫，從而危害宿主的營養(yǎng)和代謝途徑[40]。此外，感染EHP 的病蝦相較于健康蝦，血淋巴中白蛋量、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)均顯著上升[41]，同時(shí)EHP 感染，會(huì)改變蝦類的腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而破壞抵御病原體入侵的重要生物屏障，影響蝦的營養(yǎng)代謝和免疫功能[15]。

4 檢測(cè)方法

感染EHP 的蝦癥狀并不明顯，可以通過組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)[12]。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的組織切片制作時(shí)間較長(zhǎng)且流程復(fù)雜，當(dāng)病蝦體內(nèi)孢子含量較少時(shí)并不易被發(fā)現(xiàn)，不利于判斷養(yǎng)殖蝦類是否感染EHP。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EHP，多基于分子生物學(xué)方法，如巢式PCR、原位雜交、qRT-PCR 等，此類方法快速，靈敏度高，但對(duì)儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)要求較高。如李英瑕等[42]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)研發(fā)的EHP 檢測(cè)試劑盒，具有較高的診斷特異性和靈敏性、操作簡(jiǎn)單、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢(shì)，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)EHP 進(jìn)行檢測(cè)。近來，有研究基于碘化丙啶可穿透微孢子蟲活細(xì)胞膜的特性和孢子具有高度折光性的特點(diǎn)，利用熒光增白劑染色法及與碘化丙啶共染的雙色熒光法，可快速檢測(cè)蝦肝腸胞蟲。該方法操作簡(jiǎn)便，可在10 min 內(nèi)完成初步檢測(cè)，有利于養(yǎng)殖生產(chǎn)一線對(duì)EHP 感染的檢測(cè)[20]。

5 防治措施

EHP 因其具有由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成厚厚的胞壁，且營胞內(nèi)寄生，目前暫無針對(duì)性藥物[7]。然而，在養(yǎng)殖各個(gè)環(huán)節(jié)均有可能發(fā)生EHP 感染，需要對(duì)每個(gè)可能的環(huán)節(jié)做好防范，降低感染的風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)[43]，孢子在-20 ℃冷凍＞2 h 或分別浸泡在15 mg/L KMnO4、40 mg/L 65%活性氯或20%乙醇中15 min，其中的極絲釋放受抑制，無法形成芽體，從而失去增殖能力?；谠摪l(fā)現(xiàn)，商用飼料或餌料可以在投喂前進(jìn)行冷凍處理，同時(shí)可以利用高錳酸鉀、活性氯或乙醇，對(duì)池塘進(jìn)行處理。若池塘曾感染EHP，可在放苗前翻耕底泥，池底使用生石灰、高錳酸鉀等物質(zhì)消毒，亦可破壞其生存環(huán)境，降低蝦類被感染的風(fēng)險(xiǎn)[44]。Pattarayingsakul 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖水體中，蝦肝腸胞蟲孢子會(huì)因10 d 不充氧而失活，或用體積分?jǐn)?shù)為20×10-6的次氯酸鈣（濃度90%）處理24 h，迅速滅活。為預(yù)防EHP 傳播，在進(jìn)行親蝦的繁育前，應(yīng)對(duì)苗種進(jìn)行檢測(cè)，以防傳播，也應(yīng)對(duì)池塘進(jìn)行相應(yīng)處理。日常的養(yǎng)殖管理需要及時(shí)清理病死蝦、蝦代謝廢物和糞便，嚴(yán)格把控養(yǎng)殖水體的水質(zhì)、來源，以防水體感染；可在飼料中添加可以保護(hù)肝胰腺、腸道的物品，提升蝦免疫力。

6 結(jié)語

EHP 嚴(yán)重影響全球?qū)ξr養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，是實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖必須解決的重要問題之一。目前關(guān)于蝦肝腸胞蟲仍存在較多未研究清楚的問題，如EHP 的入侵機(jī)理、特效藥的研究開發(fā)等。因此，接下來關(guān)于蝦肝腸胞蟲的防治工作可以圍繞這幾方面開展，同時(shí)還可以繼續(xù)篩選具有抗EHP 的優(yōu)良養(yǎng)殖品種。