劉 超, 李仕蓉, 喬志偉

(安順學院 資源與環(huán)境工程學院, 貴州 安順 561000)

0 引言

【研究意義】環(huán)境激素,也被稱為環(huán)境內分泌干擾物,是一組高度穩(wěn)定和持久的有機化合物,難以被微生物降解[1]。土壤中的微生物對于土壤生態(tài)系統(tǒng)的構建非常重要[2-4],土壤微生物是土壤中生物活性的重要組成部分,可反映土壤環(huán)境質量的情況[2]。土壤中的微生物以細菌為主,而細菌群落中含有大量具有一定功能的生理類群,如硝化細菌、氨化細菌、固氮菌等[4-5]。土壤中細菌種類或豐度的變化可直接或間接影響某些生理類群的豐度,從而影響土壤肥力。環(huán)境激素進入土壤中,可能對土壤中微生物產生影響,進而影響土壤環(huán)境質量導致農作物減產,弄清微生物對環(huán)境激素脅迫的響應機制至關重要。【前人研究進展】目前,關于環(huán)境激素對微生物的影響研究較多,已有學者研究了不同環(huán)境激素下土壤細菌群落的變化[6-7],如郭楊等[8]通過RAPD法研究發(fā)現,PAEs(鄰苯二甲酸鹽類)復合污染提高了土壤基礎呼吸,但降低了土壤微生物多樣性;謝慧君等[9]利用BIOLOG和RAPD法研究表明,PAEs的濃度越高,對微生物代謝活性的抑制越大,可能是環(huán)境激素抑制了微生物的代謝活性,從而降低了微生物的多樣性;劉杰等[10]通過平板稀釋法研究表明,環(huán)境激素皂甙元在高濃度條件下(80 mg/kg)對土壤中的細菌、真菌、放線菌有明顯抑制作用;夏慶兵等[11]利用熏蒸提取-容量分析法研究發(fā)現,鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)對土壤呼吸強度和土壤微生物生物碳量均有影響,并隨著DEHP濃度增加呈先升高后降低的趨勢;王鑫宏[12]采用氯仿熏蒸-提取方法研究表明,DEHP進入土壤后會影響土壤微生物活性,對微生物碳量表現為降低-升高-降低-穩(wěn)定的發(fā)展趨勢;劉暢等[13]利用熒光定量PCR和DGGE相結合的方法,通過控制不同雙酚A(BPA)濃度和通氣條件研究發(fā)現,不同BPA濃度條件下,微生物豐度指數差異顯著,BPA濃度對細菌基因豐度的影響也有顯著變化。【研究切入點】以上研究均基于單獨的環(huán)境激素脅迫,而復合環(huán)境激素對土壤微生物群落多樣性的研究尚少?！緮M解決的關鍵問題】通過選取環(huán)境激素中具有典型代表的2種DEHP和BPA物質,應用16sRNA高通量測序技術,探討DEHP和BPA單一及復合濃度脅迫對土壤細菌群落的變化,深入分析環(huán)境激素對土壤細菌群落多樣性和結構的影響,為受環(huán)境激素污染土壤的改良和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

試驗地位于貴州省安順市西秀區(qū),該地區(qū)屬于亞熱帶濕潤高原季風氣候,年平均溫度13.2～14.0 ℃,年平均降雨量968～1 309 mm,年平均相對濕度80%,是土壤生物多樣性研究的合適取樣點。試驗選取金刺梨種植地土壤,在其中設置面積為3 m×3 m的樣方,以五點取樣法采集試驗區(qū)表層0～20 cm處的土壤。

1.2 試驗設計

供試土壤中分別添加雙酚A(BPA)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEHP)2種環(huán)境激素并設置不同環(huán)境激素濃度。依據2018年生態(tài)環(huán)境部頒發(fā)的土壤環(huán)境質量標準-農用地土壤污染風險管控標準(試行)規(guī)定的環(huán)境激素類濃度標準,試驗設置BPA、DEHP、BPA+DEHP 3種處理,每個濃度設置2個梯度,每個梯度設4個重復,共28個樣品(表1)。

表1 不同處理環(huán)境激素設置類型

供試土壤自然風干,碾碎后過2 mm篩。將BPA、DEHP、BPA+DEHP 3種組合濃度溶液加入供試土壤至過飽和狀態(tài),對照組加同體積去離子水,每天1次,連續(xù)處理7 d。將處理后的土壤風干,碾碎后過2 mm篩,取樣并送公司測序。

1.3 DNA抽提及PCR擴增

采用CTAB法提取DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查提取DNA的純度和濃度;將適量的DNA放入離心管,用無菌水稀釋至1 ng/μL。使用引物341F(5′- CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)對樣品的V3和V4區(qū)域進行PCR擴增,PCR體系(30 μL):高保真DNA聚合酶Master Mix(2×)15 μL,前后引物各(1 μmol/L)1 μL,gDNA(1 ng/μL)10 μL,ddH2O 3 μL。PCR反應程序:98 ℃預變性1 min;98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.4 Illumina Novaseq 測序

根據獲得的PCR產物濃度,將PCR產物進行等量混合,充分混合,利用濃度為2%的1×TAE進行瓊脂糖凝膠電泳,然后用Qiagen公司的Qiagen凝膠回收試劑盒對目標條帶進行凝膠回收。文庫的構建采用Illumina公司TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒,構建的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后,使用Nova Seq 6000 PE250進行上機測序。

1.5 生物信息學分析

將測序獲得的原始fastq序列文件導入QIIME2進行后續(xù)處理,然后用QIIME2 dada2插件進行質控、修剪、去噪、拼接及去除嵌合體后得到最終的特征序列(ASV)表格。將獲得ASV代表序列導入GREENGENES數據庫,根據數據庫注釋結果得到物種的分類信息表。采用ANOVA和DEseq2法鑒定7個分組和各分組樣本間基因豐度有差異的細菌。采用Alpha多樣性指數observed OTUs、ACE、Chao1、Shannon、Simpson和Coverage評估樣本的多樣性程度。Beta多樣性指數采用Bray Curtis法估計樣本之間的微生物群落結構差異性,并用PCA和NMDS圖展示。物種組成多樣性熱圖應用R軟件包“ggplot2”繪制,以探究不同處理下微生物群落內物種組成差異情況,最后使用PICRUSt 預測微生物群體可能的功能組成,使用Excel 2019對數據進行前期統(tǒng)計分析,使用SPSS 25.0對數據進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 細菌的OUT

對28個樣品金刺梨種植地土壤中16SrRNA的V3～V4區(qū)進行測序共獲得2 381 777條原始序列,過濾后獲得2 230 088條有效序列,平均每個樣品的有效序列數為79 646條,質控后獲得56 358條特征序列(ASV),質控效率為70.76%。將ASV的代表序列比對到99%相似度的GREENGENES數據庫,共得到46 214個OTUs。注釋到門、科、屬水平結果分別為98.37%、58.45%和20.18%。通過繪制稀釋曲線(圖1)看出,隨著測序深度的增加28個樣品的曲線逐漸趨向于平坦,并在測序量達45 000時獲最大值,表明,采集的樣品數量足夠多,OUTs覆蓋率高,測序深度基本覆蓋了樣品中的所有物種,反映了7個樣品的細菌群落和多樣性,可以進行后續(xù)分析。

圖1 OTUs稀釋曲線

由圖2可見,7組樣品中共有OUTs 793個。B1、B2、D1、D2、BD1和BD2分別共有1 409個、1 014個、1 588個、1 621個、1 488個和1 353個OUTs。7組樣品的微生物多樣性在OUTs存在差異,與CK相比,施用環(huán)境激素后土壤中OUTs總數目均減少,B1、B2、D1、D2、BD1和BD2組分別減少43.73%、59.50%、36.58%、35.26%、40.58%和45.97%,表明BPA比DEHP和復合濃度對土壤微生物的影響更大,復合濃度比DEHP對土壤微生物的影響大,總體看,環(huán)境激素的施用減少了土壤中微生物種類的數量。

圖2 不同樣品OUTs花瓣圖

2.2 土壤細菌的豐富度及多樣性

如表2所示,施用不同濃度環(huán)境激素后,樣本細菌群落豐富度和多樣性均有顯著變化。與CK相比,6個處理組的ACE和Chao1指數均顯著降低,說明環(huán)境激素降低了微生物群落的相對豐度;D2處理組Shannon指數與CK無顯著差異,但其他5個處理組的Shannon指數均顯著低于CK;D1和D2處理組Simpson指數與CK無顯著差異,剩余4個處理組與CK有顯著差異。即,BPA組ACE和Chao1指數低于DEHP組和組合濃度組,BD2組ACE和Chao1指數低于B2和D1、D2組,且有顯著性差異;BPA組Shannon指數低于DEHP和復合組,復合組Shannon指數低于D2組且有顯著性差異。另外7組樣品的Coverage指數均接近于最大值1,反映該次測序深度符合試驗要求并代表了樣本中微生物的真實情況?？傮w看,由于環(huán)境激素對微生物的毒害作用,致使處理組微生物豐富度和多樣性降低。

表2 土壤細菌豐富度指數及多樣性指數

2.3 土壤微生物群落結構

2.3.1 門水平 由圖3可知,不同組別土壤中占據優(yōu)勢地位的菌群主要包括變形菌門(Proteobacteria,占31.37%)、酸桿菌門(Acidobacteria,占29.67%)、放線菌門(Actinobacteria,占10.28%)、綠彎菌門(Chloroflexi,占9.81%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,占6.72%),其相對豐度大于5%,約占總序列的87.75%,其次是泉古菌門(Crenarchaeota,占2.42%)、WPS_2(Camdidatus Eremiobacterota,占2.28%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,占1.89%)、厚壁菌門(Firmicutes,占1.71%),平均相對豐度均大于1%;其余門類的相對豐度均小于1%,包括疣微菌門(Verrucomicrobia,占0.82%)、消化螺旋菌門(Nitrospirae,占0.67%)等。在不同環(huán)境激素濃度條件下,各組微生物的群落組成發(fā)生了變化,環(huán)境激素脅迫處理顯著影響土壤細菌門水平群落結構。各處理組間,B1、B2組中厚壁菌門(Firmicutes)、泉古菌門(Crenarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)比D1、D2、BD1、BD2組多;BD1、BD2組中WPS_2比其余處理組顯著增多;D2組中放線菌門(Actinobacteria)、消化螺旋菌門(Nitrospirae)比B1、B2、BD2、D1組中顯著增多。與CK相比,處理組土壤細菌中的藍藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)減少,而消化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)增多。說明,在消化螺旋菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、泉古菌門中可能存在大量對環(huán)境激素敏感的群落,在環(huán)境激素刺激下大量出現,導致以上3個門占比較CK高,群落結構復雜。

圖3 土壤細菌群落聚類分析熱圖

2.3.2 屬水平 由圖3可見,在屬的水平上,通過序列比對確定每個樣品中相對豐度較高的前20個屬,其中,念珠菌固體桿菌屬(Candidatus_Solibacter,3.09%)、凱氏桿菌屬(Kaistobacter,2.64%)、紅游動菌屬(Rhodoplanes,1.70%)、柯氏假絲酵母菌屬(Candidatus_Koribacter,1.68%)4個屬的平均相對豐度大于1%,占樣品中總序列的9.11%。不同環(huán)境激素處理土壤主要細菌屬的相對豐度差異顯著,與CK相比,施用環(huán)境激素的6個土壤處理組中黃色土源菌屬(Flavisolibacter)、凱氏桿菌屬(Kaistobacter)、德沃氏菌屬(Devosia)顯著減少,而念珠菌固體桿菌屬(Candidatus_Solibacter)、柯氏假絲酵母菌屬(Candidatus_Koribacter)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)相對豐度顯著高于CK。各處理間種屬組成也有差異,B1、B2組中普氏棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌數屬(Ruminococcus)、鏈孢菌屬(Catellatospora)比D1、D2、BD1、BD2組顯著增多,BD1、BD2組中念珠菌固體桿菌屬(Candidatus_Solibacter)比其余4個處理組多,D1、D2組中分歧桿菌屬(Mycobacterium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)比B1、B2、BD1、BD2處理組顯著增多。

2.4 不同分析方法土壤微生物群落結構

2.4.1 主成分PCA分析法 由圖4可見,軸1(PC1)、軸2(PC2)貢獻值和總貢獻值分別為15.12%、7.47%和22.59%。6個處理組均與CK距離較遠,說明經過環(huán)境激素處理后試驗組與CK群落結構差異較大,同時D1、D2、BD1、BD2各組間距離較遠,表明群落結構發(fā)生了變化,但B1與B2組間點有部分重合,距離較近,群落相似性高,群落組成比較接近。說明,刺梨種植地土壤經不同環(huán)境激素濃度處理后土壤的細菌群落結構有較大改變。

2.4.2 非度量多維尺度分析法 由圖5顯示,細菌群落結構受不同環(huán)境激素顯著影響(Stress=0.04),各處理組與CK的距離較遠,說明處理組與對照組間微生物群落結構差異度較大;各處理組間,D1與D2組間距離較遠,群落相似度低,而B1與B2、BD1與BD2組間距離較近,表明其群落相似度較高,而單一因素BPA組與單一因素DEHP組以及復合濃度組間距離較遠,說明單一濃度與復合濃度組間的微生物群落結構差異度較大,群落相似度較低,這與前面的PCA主成分分析結果相同。表明,在不同環(huán)境激素濃度處理下,土壤微生物群落結構發(fā)生改變,與對照組相比,試驗組群落結構改變較大,說明在環(huán)境激素的刺激下,土壤中微生物的豐富度和均勻度均發(fā)生改變,導致微生物群落結構改變。

圖5 非度量多維尺度分析不同處理土壤微生物的群落結構

2.5 土壤細菌菌群功能

由圖6可見,氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、輔因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、其他氨基酸代謝(Metabolism of other amino acids)、次生產物代謝的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)、脂質代謝(Lipid metabolism)、全局概覽圖(Global and overview maps)、異生物素的生物降解和代謝(Xenobiotics biodegradation and metabolism)等20個子功能預測基因占比在7個樣品分組中約為90%,其中,氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝、次生產物代謝的生物合成、脂質代謝為預測的優(yōu)勢功能基因,占比分別為11.15%、9.38%、9.31%、6.55%、6.35%、6.15%,可見,以上功能主要屬于代謝類型。

由圖6可見,在三級功能層級,大部分功能屬于未知,約占總和的70.57%,在已知的預測基因功能主要跟生物合成相關,其功能基因豐度在每個樣品中均大于1%,豐度總和約為16%,其中萜類化合物和類固醇的生物合成、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸生物合成、細菌趨藥性、脂肪酸合成、酮體的合成和降解為預測的優(yōu)勢功能基因,占比分別約為2.39%、2.14%、1.70%、1.68%和1.65%,其余大部分預測功能基因與物質代謝如生物素代謝、硫辛酸代謝、氨基酸及其衍生物代謝、遺傳信息和細胞運動相關。

3 討論

近年來,由PAEs和BPA引起的環(huán)境污染問題已受到廣泛關注,我國農田土壤高濃度環(huán)境激素檢出率增高[13-20]。曹龍等[21]研究發(fā)現,珠三角地區(qū)的農業(yè)土壤中PAEs的平均濃度為21.03 mg/kg;楊彥等[22]發(fā)現江蘇南部太湖流域農田土壤中15種PAEs總濃度為44.56 mg/kg;夏炎等[23]對廣東省6個市的農耕土壤進行調查發(fā)現,四溴雙酚A平均含量為0.61 ng/g DW,農耕土壤中的四溴雙酚A平均蓄積量為4.57 t。環(huán)境激素通過不同途徑進入土壤中長期殘存將嚴重影響土壤肥力以及農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,可造成農產品病變、失綠、營養(yǎng)元素丟失,甚至導致農作物死亡等。土壤微生物與土壤肥力密切相關,對土壤的形成與發(fā)育過程中物質循環(huán)和能量轉化起至關重要的作用,有利于保持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能,是土壤質量的重要指標之一[24]。環(huán)境激素的施用影響土壤中微生物活動,微生物之間的種間關系、生物量和生物活性會產生一定程度的降低,從而降低土壤肥力。張建等[25]研究表明,PAEs進入土壤中會影響β-葡萄糖苷酶、磷酸酶、脲酶、蛋白酶活性,降低土壤環(huán)境質量。研究結果表明,不同濃度環(huán)境激素對細菌α-多樣性ACE和Chao1指數顯著降低,除D2處理組Shannon指數與CK無顯著差異外,其余5個處理組Shannon指數均低于CK并存在顯著差異,D1和D2組 Simpson指數與CK無顯著差異,剩余4個處理組均和CK有顯著差異;BPA組ACE和Chao1指數低于DEHP組和組合濃度組,BD2組ACE和Chao1指數低于B2和D1、D2組,且有顯著性差異;BPA組Shannon指數低于DEHP和復合組,復合組Shannon指數低于D2組,且有顯著性差異?？傮w看,環(huán)境激素對微生物多樣性影響最大的是單一BPA,其次是BD復合環(huán)境激素,最后是單一DEHP。BPA和DEHP作為增塑劑主要用于塑料包裝中,DE SOUZA等[26]研究表明,微塑料中的增塑劑等有害物質進入土壤中,抑制土壤中細菌的生長。高分子量的DEHP在土壤中不容易降解,而相對分子量比較低的BPA可穿過細菌的細胞膜從而被細菌吸收和降解。因此,DEHP處理組比BPA和BD復合組微生物豐度增加。

細菌群落β-多樣性分析表明,單一及復合環(huán)境激素處理土壤細菌群落結構差異顯著?？傮w上,不同處理土壤細菌優(yōu)勢門類為變形菌門(Proteobacteria,占31.37%)、酸桿菌門(Acidobacteria,占29.67%)、放線菌門(Actinobacteria,占10.28%)、綠彎菌門(Chloroflexi,占9.81%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,占6.72%),其相對豐度大于5%,約占總序列的87.75%,這與張慧敏等[27]的研究結果類似;同時PCA、NMDS聚類分析表明,在不同環(huán)境激素的刺激下,土壤中微生物的豐富度和均勻度均發(fā)生了改變,單一BPA環(huán)境激素中厚壁菌門、泉古菌門、浮霉菌門和擬桿菌屬豐度較高,單一DEHP中放線菌門、消化螺旋菌門和分歧桿菌屬、伯克霍爾德菌屬豐度較高,BD復合環(huán)境激素中WPS-2和念珠菌固體桿菌屬豐度較高,微生物群落結構發(fā)生改變,這與解開治等[28]的研究結果相同。不同濃度激素組合處理下細菌門類水平分布特征與已有的研究結果類似[29],劉沙沙等[30]的研究也表明,在微塑料-多環(huán)芳烴污染條件下聚氯乙烯-芘改變了菌群的代謝進程,引起了微生物群落結構和功能的改變。這可能是環(huán)境激素污染物進入土壤后降低了土壤微生物群落的生理代謝活性和碳源利用能力,從而降低了微生物的多樣性、改變了微生物群落結構。

研究結果表明,在二級功能層面,微生物功能以氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝、次生產物代謝的生物合成、脂質代謝為預測的優(yōu)勢功能基因;而在三級功能層面已知的預測的基因功能主要跟生物合成相關,跟生物合成相關的功能基因豐度在每個樣品中均大于1%,豐度總和約為16%,其余大部分預測功能基因與物質代謝如生物素代謝、硫辛酸代謝,氨基酸及其衍生物代謝、遺傳信息和細胞運動相關。靳曉拓等[31]研究表明,對芒果園土壤施用多效矬后,在二級功能層面以碳水化合物代謝、次生產物代謝的生物合成、氨基酸代謝等為主;蒙小俊等[32]對漢江上游污水處理廠的微生物多樣性和功能預測研究表明,氨基酸代謝、碳水化合物代謝、次生產物代謝的生物合成以及蛋白質的新陳代謝、遺傳信息和物質代謝等有關,這與本研究結果一致。通過16S RNA高通量測序技術方法并運用PICRUSt軟件進行微生物功能預測分析,揭示了單一及復合環(huán)境激素脅迫下土壤微生物的多樣性、結構及其功能組成,但鑒于PICRUSt功能預測分析的局限性和土壤環(huán)境的復雜性,后續(xù)需要結合土壤環(huán)境因子和宏基因組測序技術作進一步分析。

4 結論

單一及復合環(huán)境激素進入土壤后顯著減少土壤OTUs數量,土壤細菌群落Alpha多樣性顯著降低,總體看,ACE指數、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數具體表現為BPA組