劉文霖, 趙瑞娟, 蘇賢坤, 薛小平, 鄭曉曼, 耿召良

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴州 貴陽 550081; 2.上海煙草集團北京卷煙廠有限公司, 北京 101121; 3.中國煙草總公司 海南省公司, 海南 ?？?570106)

0 引言

【研究意義】自由基在生物體內(nèi)普遍存在,自由基的水平與生物體的代謝活躍程度緊密相關(guān),是人體內(nèi)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的化合物,具有強氧化性,可損害肌體組織和細胞,進而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。卷煙在燃燒過程中產(chǎn)生大量自由基,煙氣中的自由基可分成兩類,一類為粒相自由基,如醌/半醌自由基、多環(huán)芳烴自由基、石墨碳和磷自由基,其分子量較大,穩(wěn)定性較高;另一類為氣相自由基,如烷類自由基、烷氧自由基和氧自由基等,其重量小,穩(wěn)定性差[1]。目前,自由基對吸煙者健康的影響引起了煙草科技工作者的廣泛關(guān)注。清除卷煙煙氣中自由基的主要方法是向煙絲和濾嘴中加入自由基清除劑[2]。所用的清除劑主要有天然植物類抗氧化劑[3-7]、氨基酸、酶及維生素類[8-10]、微量元素[11]和天然礦物質(zhì)[12-13]等。刺梨(Rosaroxbunghii)屬薔薇科薔薇屬茨梨的果實,為貴州特色植物資源;無籽刺梨屬薔薇科薔薇屬多年生攀援類果樹,為貴州特有品種,富含多糖、維生素C、SOD活性物質(zhì)和多酚等物質(zhì),抗氧化作用顯著。對煙草-刺梨提取物為底物的美拉德(Maillard)反應(yīng)產(chǎn)物清除煙氣中氣相自由基的效果進行研究,對降低烤煙燃燒過程中的自由基含量以及卷煙提質(zhì)增香具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Maillard反應(yīng)也稱羰氨反應(yīng),主要指醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等含氮化合物的游離氨基之間發(fā)生的一系列反應(yīng),因其具有安全和制備簡單等特點,其在生物醫(yī)藥、食品等方面廣泛應(yīng)用。王惠英等[14-17]研究表明,Maillard產(chǎn)物除了能補充卷煙的香味外,還具有抗氧化性。Maillard反應(yīng)中間階段產(chǎn)物包括還原酮、醛及雜環(huán)化合物,終產(chǎn)物為大分子類黑色素和芳香化合物。以煙草提取物為底物的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物能產(chǎn)生與煙草協(xié)調(diào)的香味,對降刺除雜和改善余味效果明顯[18]。何江等[19]研究表明,強化SOD刺梨汁可提高患者機體抗氧化物質(zhì)的活性和含量;楊江濤等[20]研究刺梨多糖對衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響表明,刺梨多糖可以劑量依賴性地提高衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化能力;何偉平等[21]以野生刺梨果提取的刺梨粉為對象,研究其清除羥自由基能力的結(jié)果表明,刺梨粉對羥自由基的清除作用優(yōu)于抗壞血酸及其他抗氧化劑,是抗壞血酸的47倍?！狙芯壳腥朦c】刺梨具有清除自由基和保健作用等功能,目前,有關(guān)烤煙-刺梨提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物清除煙氣中氣相自由基的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以烤煙提取物和刺梨提取物為反應(yīng)底物進行Maillard反應(yīng),研究Maillard反應(yīng)產(chǎn)物清除煙氣中氣相自由基的最佳比例及其對烤煙感官質(zhì)量的影響,以期為卷煙提質(zhì)增香提供新的路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 烤煙和刺梨 供試烤煙品種為云煙87,由遵義產(chǎn)區(qū)、畢節(jié)產(chǎn)區(qū)、黔西南產(chǎn)區(qū)提供,選取等級為C3F初烤煙葉,去梗切成寬1 mm煙絲,并卷制成煙支,分別標(biāo)記為烤煙a、烤煙b和烤煙c;刺梨干果和卷煙(品牌A、品牌B、品牌C)均市購;

1.1.2 試劑 甘氨酸(生物純)、1,2-丙二醇(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、二氯甲烷(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、無水乙醇(分析純)和CCl4(分析純)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;2-苯基叔丁基硝酮(N-t-Butyl-α-phenylnitro,PBN,分析純)購自阿拉丁;水為去離子水。

1.1.3 儀器設(shè)備 X85-2恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司),LR4011/G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph),7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)譜儀(美國安捷倫公司),順磁共振儀(德國布魯克的EMX-6/1),吸煙機Omerica ASM20+(歐美利華)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 烤煙提取物的制備。取等級為C3F的K326煙葉2 kg,去梗切成寬1 mm煙絲,以90%乙醇對煙絲進行加熱回流提取3次,合并濾液,回流至無醇味,得到煙草提取物。

2) 刺梨提取物的制備。將刺梨干果置于60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,粉碎,過40目篩,所得粉末用80%乙醇加熱回流提取5次,去雜,每次2 h,用漏斗過濾提取液,回流至無醇味,得到刺梨提取物。

3) Maillard反應(yīng)產(chǎn)物提取。參照劉文霖等[22]方法,將煙草提取物和刺梨提取物按最佳Maillard反應(yīng)條件(初始pH為7、反應(yīng)溫度為113 ℃、反應(yīng)時間為5.5 h、物料比為32.6%)提取Maillard反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 試驗設(shè)計

1) Maillard反應(yīng)產(chǎn)物不同用量清除初烤煙葉煙氣中氣相自由基試驗。使用微量注射器,將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物分別按煙絲重量的0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、0.70%、1.00%、1.50%注入煙支濾嘴中,3次重復(fù)。處理好的煙支置于溫度(22±2)℃、濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后待測,確定最佳比例。

2) Maillard反應(yīng)產(chǎn)物清除卷煙和初烤煙葉煙氣中氣相自由基試驗。確定Maillard反應(yīng)產(chǎn)物∶煙絲重量的重量比為0.50%,分別將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物按比例均勻添加在卷煙(品牌A、品牌B和品牌C)和初烤煙葉(烤煙a、烤煙b和烤煙c)的煙絲中,3次重復(fù),分別測定處理前和處理后煙氣中氣相自由基含量。上述處理同樣分別添加在對應(yīng)煙支的濾嘴中,重復(fù)3次,分別測定處理前和處理后煙氣中氣相自由基含量。

3) Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對感官評價的影響試驗。將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物按煙絲重量的3‰均勻噴灑到烤煙a中,以未添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的烤煙a為對照,將煙支放于溫度(22±2)℃、濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進行感官質(zhì)量評價。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 氮雜環(huán)類物質(zhì)測定 采用7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀分析氮雜環(huán)香氣物質(zhì)。色譜柱為HP-5MS(60 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱,進樣量1 μL;進樣口溫度:280 ℃;分流比:20∶1;柱流速:1.0 mL/min;升溫程序:40 ℃保持3 min,然后以6 ℃/min升至280 ℃保持7 min。質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;電離能70 eV;傳輸線溫度280 ℃;全掃描質(zhì)量數(shù)為45～450 aum,溶劑延遲6 min;采集模式為全掃描(Fullscan)與選擇離子檢測(SIM)同時采集。MS譜庫:NIST08庫和Willy08庫。

1.3.2 氣相自由基測定 將氣相自由基捕集裝置連接吸煙機,捕集液CCl4溶液濃度0.01 mol/L,體積8 mL。捕集前預(yù)熱15 min,然后將煙支插入吸煙機的煙支夾持器,依據(jù)《卷煙 用常規(guī)分析用吸煙機測定 總粒相物和焦油》(GB/T 19609—2004)[23]抽吸煙支,每次捕集20支煙,抽吸結(jié)束后立即將捕集液轉(zhuǎn)移至10.00 mL冷凍管并置于-80 ℃液氮中保存,備用。捕集液解凍后,參照周駿等[24]的方法,取100 μL到核磁管中,插入順磁儀進行自由基檢測。

1.3.3 感官評價 依據(jù)《煙草及煙草制品 感官評價方法》(YC/T 138—1998)[25],由9名專家進行感官評價,評價指標(biāo)包括香氣質(zhì)、香氣量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SPSS 25.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物主要氮雜環(huán)類物質(zhì)及其含量

從表1看出,刺梨-煙草提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物檢測的氮雜環(huán)類物質(zhì)總量為236.68 μg/mL,共有18種。其中,吡啶類氮雜環(huán)化合物含量最高,達193.21 μg/mL,具有面包烘烤香味;2-乙基-3-羥基-4-吡喃酮和2-乙?；邕蚝枯^高,分別為35.78 μg/mL和5.65 μg/mL,具有焦糖、果香味和較濃烤香味。表明,刺梨-煙草提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物氮雜環(huán)類物質(zhì)種類多,含量高,具有提升香氣的作用。

表1 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的主要氮雜環(huán)類物質(zhì)及其含量

2.2 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物不同用量對初烤煙葉氣相自由基的清除效果

由圖1可知,隨Maillard反應(yīng)產(chǎn)物添加量增加,煙氣中氣相自由基清除率大致呈先升后降趨勢。當(dāng)添加量由0.01%增至0.50%時,氣相自由基清除率由5.20%升至18.28%,以添加量為0.50%時的氣相自由基清除率達最高(18.28%);當(dāng)添加量由0.50%增至1.00%時,氣相自由基清除率由18.28%降至10.88%;當(dāng)添加量由1.00%增至1.50%時,氣相自由基清除率變化不大,基本維持在11.00%。綜合初烤煙葉氣相自由基的清除效果和成本,Maillard反應(yīng)產(chǎn)物以添加量0.50%最佳。

圖1 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物不同用量清除煙氣中氣相自由基的清除率

2.3 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對卷煙及初烤煙葉氣相自由基的清除效果

由圖2A和圖2B可知,將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對卷煙和初烤煙葉的煙絲和濾嘴氣相自由基的清除效果存在差異。煙絲:卷煙品牌A、品牌B、品牌C、烤煙a、烤煙b和烤煙c處理前的氣相自由基含量平均值分別為21.95×1014spin/支、10.07×1014spin/支、7.89×1014spin/支、10.26×1014spin/支、8.48×1014spin/支和8.94×1014spin/支,處理后分別為19.74×1014spin/支、9.28×1014spin/支、7.08×1014spin/支、9.39×1014spin/支、7.72×1014spin/支和8.10×1014spin/支。其中,卷煙品牌A、品牌B和品牌C處理后的氣相自由基含量均極顯著低于處理前,且氣相自由基清除率分別為10.07%、7.85%和10.27%?？緹焌和烤煙b處理后的氣相自由基含量均極顯著低于處理前,烤煙c處理前、后的氣相自由基含量差異不顯著,其氣相自由基清除率分別為8.48%、8.97%和9.39%。濾嘴:卷煙品牌A、品牌B、品牌C、烤煙a、烤煙b和烤煙c處理前的氣相自由基含量分別為21.95×1014spin/支、10.07×1014spin/支、7.89×1014spin/支、10.26×1014spin/支、8.48×1014spin/支和8.94×1014spin/支,處理后分別為18.14×1014spin/支、8.71×1014spin/支、6.40×1014spin/支、8.96×1014spin/支、7.01×1014spin/支和7.68×1014spin/支。其中,卷煙品牌A、品牌B和品牌C處理后的氣相自由基含量均極顯著低于處理前,且氣相自由基清除率分別為17.36%、13.51%和18.89%。烤煙a和烤煙b處理后的氣相自由基含量均極顯著低于處理前,烤煙c處理后的氣相自由基含量顯著低于處理前,其氣相自由基清除率分別為12.67%、17.33%和14.09%。表明,將Maillard反應(yīng)產(chǎn)物添加在卷煙和初烤煙葉煙絲和濾嘴中,清除煙氣中自由基效果明顯,且添加在濾嘴的清除效果更好。

注:不同大、小寫字母表示差異達極顯著(P<0.01)和顯著水平(P<0.05),下同。

圖2B 卷煙及初烤煙葉濾嘴中氣相自由基的含量

2.4 添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物烤煙a的感官評價

由Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對感官評價的影響試驗結(jié)果表明,未添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物(CK)處理烤煙煙香稍單薄,稍有甜感;添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物后,烤煙的煙香氣較豐富,煙香味明顯,甜感明顯增加,回味較厚重。表明,添加3‰ Maillard反應(yīng)產(chǎn)物可有效改善烤煙的感官質(zhì)量。

3 討論

貴州具有極大的煙草資源優(yōu)勢。無籽刺梨是貴州特有的刺梨資源,因其豐富的營養(yǎng)和抗氧化作用在食品、醫(yī)藥中應(yīng)用較多。利用貴州豐富的煙草資源和獨有的刺梨物種,研究煙草、刺梨提取物美拉德反應(yīng)的抗氧化作用及其在卷煙中的加香效果,驗證了煙草美拉德反應(yīng)物的抗氧化活性,同時在前人基礎(chǔ)上,進一步驗證了Maillard產(chǎn)物具有對煙氣中氣相自由基的清除能力,其中,反應(yīng)產(chǎn)物添加在煙絲及濾嘴中的清除效果存在差異。刺梨提取物與煙草提取物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物添加至煙絲中時,在煙絲燃燒過程中,二者反應(yīng)產(chǎn)物一方面發(fā)揮著清除自由基的作用;另一方面,其自身一部分也會在燃燒過程中裂解出自由基,因此,當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物添加至煙絲中,最終測定的自由基含量由以上兩方面共同作用決定。當(dāng)添加量在一定范圍內(nèi),二者反應(yīng)產(chǎn)物自身裂解產(chǎn)生的自由基較少,以清除自由基為主導(dǎo),隨著添加量不斷增加超過一定范圍時,自由基降低率反而降低。因此,二者反應(yīng)產(chǎn)物的添加量應(yīng)控制在一定的范圍內(nèi)。綜合考慮烤煙-刺梨提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物清除煙氣中氣相自由基的成本和清除效果,反應(yīng)物添加量為0.3%較為適宜。

試驗僅研究了煙氣中氣相自由基的含量變化,以及Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對煙氣中自由基的清除作用。目前,尚未見有關(guān)側(cè)流煙氣自由基的報道,因此,檢測側(cè)流煙氣和環(huán)境中煙氣自由基濃度,分析其對吸煙者和周圍環(huán)境具有現(xiàn)實意義。但當(dāng)前抗氧化劑的清除效率不高,如何開發(fā)出一種既能保持卷煙吸味,又能高效降低煙氣中自由基的清除劑是值得深入研究的重要課題,在今后可進一步探究抗氧化劑清除煙氣中氣相及粒相自由基的機制。

4 結(jié)論

刺梨-煙草提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物檢測的氮雜環(huán)類物質(zhì)總量為236.68 μg/mL,共有18種,以吡啶類氮雜環(huán)化合物含量最高,達193.21 μg/mL,具有面包烘烤香味。Maillard反應(yīng)產(chǎn)物添加量為0.50%時,煙氣中氣相自由基清除率最高,為18.28%;且添加在卷煙煙絲中,卷煙品牌A、品牌B和品牌C的氣相自由基清除率分別為10.07%、7.85%和10.27%,烤煙a、烤煙b和烤煙c分別為8.48%、8.97%和9.39%;添加在卷煙濾嘴中,卷煙品牌A、品牌B和品牌C的氣相自由基清除率分別為17.36%、13.51%和18.89%,烤煙a、烤煙b和烤煙c分別為12.67%、17.33%和14.09%。與未添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物比,添加Maillard反應(yīng)產(chǎn)物后,烤煙a的煙香氣較豐富,煙香味明顯,甜感明顯增加,回味較厚重。表明,刺梨-煙草提取物Maillard反應(yīng)產(chǎn)物氮雜環(huán)類物質(zhì)種類多,含量高,具有提升香氣的作用;添加0.5% Maillard反應(yīng)產(chǎn)物,其清除煙氣中氣相自由基的效果最佳,且添加在濾嘴中的效果更好;添加3‰Maillard反應(yīng)產(chǎn)物可有效改善烤煙的感官質(zhì)量。