徐 洋，王 敏，張恒璐，周 莉，陸衛(wèi)平

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安 223300

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）發(fā)生的主要原因［1］。DKD的病理特征是腎小球硬化、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增加、腎小管萎縮和腎小管間質(zhì)纖維化［2］。越來越多的研究表明腎小管上皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及纖維化在DKD 的進(jìn)展中起重要作用，然而目前DKD 的治療仍以控制血糖、血壓、調(diào)節(jié)血脂為主要治療原則，在抗纖維化方面效果并不明顯［3］。

達(dá)格列凈是一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodium-glucose transporter 2，SGLT-2）抑制劑，可以抑制葡萄糖的重吸收，促進(jìn)尿糖排出，降低血糖。近年來研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈還具有腎臟保護(hù)作用［4］，然而其具體機(jī)制尚未明確。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是作用最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子，通過介導(dǎo)多種信號(hào)參與腎纖維化的發(fā)生發(fā)展［5］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）是STAT 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，與高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、TGF-β1的表達(dá)以及ECM蛋白Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白（Fibronectin）的產(chǎn)生有關(guān)［6］。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，可以嚴(yán)格調(diào)控TGF-β超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rffl 是一種能抑制內(nèi)體再循環(huán)的E3 泛素連接酶，可通過調(diào)控PRR5L 降解促進(jìn)mTORC2介導(dǎo)的PKC-δ磷酸化從而延緩肺纖維化進(jìn)展［7］。然而Rffl 在腎纖維化中的作用還未見報(bào)道。設(shè)想達(dá)格列凈的腎保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)Rffl的表達(dá)抑制STAT1/TGF-β1通路相關(guān)。

本研究通過高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞模擬糖尿病腎病環(huán)境，探討達(dá)格列凈是否通過上調(diào)Rffl 的表達(dá)抑制STAT1/TGF-β1信號(hào)通路從而改善DKD腎小管上皮細(xì)胞的EMT和纖維化，為DKD的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 細(xì)胞（上海中喬新舟公司）；胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基（含有4.5 g/L D-葡萄糖）、DMEM 低糖培養(yǎng)基（含有1 g/L D-葡萄糖）、0.25%胰蛋白酶、鏈霉素、青霉素（Gibco 公司，美國）；達(dá)格列凈（Med Chem Express公司，美國）；鼠抗上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin）、STAT1、α-Tubulin 單克隆抗體，兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Rffl多克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美國）；Trizol、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000脂質(zhì)體（Invitrogen公司，美國），RT-PCR試劑（南京諾唯贊公司），RT-PCR引物（南京金斯瑞公司）；大腸桿菌DH5α（北京擎科生物科技有限公司）；空載質(zhì)粒PCDH和重組PCDHRffl 質(zhì)粒（廣州易錦生物技術(shù)有限公司）；PCR 儀（Eppendorf公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞收縮變圓后加入完全培養(yǎng)基終止消化，傳代。傳代后的細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液1 次，以去除死亡的細(xì)胞，以后每2 d 換液1 次。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 分組

收集對(duì)數(shù)期HK-2 細(xì)胞，使用含4.5 g/L 葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，記作高糖組（HG組）；使用含有1 g/L 葡萄糖的DMEM 低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，記作對(duì)照組（NC 組）。收集對(duì)數(shù)期HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板，分為低劑量達(dá)格列凈+高糖組（Dap-L組，使用含有5 μmol/L 達(dá)格列凈的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h），高劑量達(dá)格列凈+高糖組（Dap-H 組，使用含有10 μmol/L 達(dá)格列凈的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h），PCDH 組（PCDH 轉(zhuǎn)至HK-2 細(xì)胞，使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h），PCDH-Rffl組（PCDHRffl轉(zhuǎn)至HK-2細(xì)胞，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）。

1.2.3 Western blot檢測(cè)

取按照上述分組培養(yǎng)48 h的各組細(xì)胞，加入適量的RIPA 細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，BCA 試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶5的比例充分混勻，100 ℃煮沸變性10 min，每個(gè)樣品取50 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，90 V 低溫電轉(zhuǎn)移2 h，5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Rffl、TGF-β1、α-Tubulin 抗體，所有抗體均按照說明書稀釋，4 ℃過夜，TBST 洗滌，分別加入1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)

采用TRIzol 法提取細(xì)胞中總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，PCR 循環(huán)條件：95 ℃30 s 預(yù)變性；95 ℃10 s，60 ℃30 s 共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 采集熔解曲線。以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Rffl mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rffl在高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中低表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)了低糖和高糖培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞Rffl 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HG 組細(xì)胞中Rffl mRNA水平較NC組明顯降低。Western blot檢測(cè)結(jié)果證明HG 組細(xì)胞中Rffl 蛋白表達(dá)較NC 組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的HK-2中Rffl的表達(dá)水平Figure 1 Rffl expression level in HK-2 cultured at different glucose concentrations

2.2 在高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中過表達(dá)Rffl

qRT-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PCDH-Rffl后，HK-2 中Rffl 的表達(dá)水平與PCDH 組相比明顯上升。Western blot 結(jié)果與qPCR 結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建過表達(dá)Rffl的HK-2細(xì)胞（P＜0.05，圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒PCDH-Rffl 轉(zhuǎn)染后Rffl 在HK-2 中的表達(dá)水平Figure 2 Expression level of Rffl in HK-2 after transfected with recombinant plasmid PCDH-Rffl

2.3 過表達(dá)Rffl抑制高糖環(huán)境中HK-2細(xì)胞的EMT和纖維化

與NC 組相比，HG 組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低，F(xiàn)ibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05，n=3）；與PCDH組相比，PCDH-Rffl組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高，F(xiàn)ibronectin、α-SMA 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，n=3，圖3），提示過表達(dá)Rffl抑制高糖環(huán)境中HK-2的EMT和纖維化。

圖3 Western blot檢測(cè)過表達(dá)Rffl對(duì)HK-2中E-cadherin、Fibronectin、α-SMA表達(dá)的影響Figure 3 The effects of Rffl overexpression on the expression of E-cadherin，F(xiàn)ibronectin and α-SMA in HK-2 detected by Western blot

2.4 達(dá)格列凈抑制高糖處理的HK-2 細(xì)胞的EMT和纖維化

與NC 組相比，HG 組細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低，F(xiàn)ibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05，n=3）；與HG組相比，Dap-L組及Dap-H組細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平均升高，F(xiàn)ibronectin、α-SMA 表達(dá)均降低（P＜0.05，n=3）；與Dap-L 組相比，Dap-H組細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平升高，F(xiàn)ibronectin、α-SMA表達(dá)均降低（P＜0.05，n=3，圖4），提示達(dá)格列凈抑制高糖處理的HK-2 的EMT 和纖維化，且達(dá)格列凈的濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。

圖4 Western blot檢測(cè)達(dá)格列凈對(duì)HK-2中E-cadherin、Fibronectin、α-SMA表達(dá)的影響Figure 4 The effects of dapagliflozin on the expression of E-cadherin，F(xiàn)ibronectin and α-SMA in HK-2 detected by Western blot

2.5 達(dá)格列凈促進(jìn)高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中Rffl 的表達(dá)

與NC組相比，HG組細(xì)胞中Rffl蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，n=3）；Dap-L組及Dap-H組細(xì)胞中Rffl表達(dá)均高于HG組（P＜0.05，n=3）；與Dap-L組相比，Dap-H組細(xì)胞中Rffl表達(dá)水平升高（P＜0.05，n=3，圖5），提示達(dá)格列凈促進(jìn)高糖培養(yǎng)的HK-2中Rffl的表達(dá)，且達(dá)格列凈的濃度越高，促Rffl表達(dá)的作用越明顯。

圖5 Western blot檢測(cè)達(dá)格列凈對(duì)HK-2中Rffl表達(dá)的影響Figure 5 The effect of dapagliflozin on Rffl expression in HK-2 detected by Western blot

2.6 過表達(dá)Rffl 抑制高糖培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞中STAT1、TGF-β1的表達(dá)

相對(duì)于NC 組，HG 組細(xì)胞中STAT1、TGF-β1 的表達(dá)水平升高（P＜0.05，n=3）；與PCDH 組相比，PCDH-Rffl 組細(xì)胞中STAT1、TGF-β1 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05，n=3，圖6），提示過表達(dá)Rffl抑制高糖培養(yǎng)的HK-2中STAT1、TGF-β1的表達(dá)。

圖6 Western blot檢測(cè)過表達(dá)Rffl對(duì)HK-2中STAT1、TGF-β1表達(dá)的影響Figure 6 The effects of Rffl overexpression on the expression of STAT1 and TGF-β1 in HK-2 detected by Western blot

2.7 達(dá)格列凈抑制高糖培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞中STAT1、TGF-β1的表達(dá)

與NC 組相比，HG 組細(xì)胞中STAT1、TGF-β1 的表達(dá)水平升高（P＜0.05，n=3）；相比HG組，Dap-L組及Dap-H組細(xì)胞中STAT1、TGF-β1表達(dá)均降低（P＜0.05，n=3）；與Dap-L 組相比，Dap-H 組細(xì)胞中STAT1、TGF-β1表達(dá)均降低（P＜0.05，n=3，圖7），提示達(dá)格列凈抑制高糖培養(yǎng)的HK-2中STAT1、TGF-β1的表達(dá)，達(dá)格列凈的濃度越高，抑制作用越顯著。

圖7 Western blot檢測(cè)達(dá)格列凈對(duì)HK-2中STAT1、TGF-β1表達(dá)的影響Figure 7 The effects of dapagliflozin on STAT1 and TGF-β1 expression in HK-2 detected by Western blot

3 討論

糖尿病是世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生疾病，在全球普通人群中的患病率約為10%。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)，到2035 年，全球糖尿病患者的數(shù)量將從2013年的3.82億增加到5.92億，其中大約40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為DKD［8］。DKD 是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致ESRD的主要因素，顯著增加了糖尿病患者的病死率。腎小管上皮細(xì)胞EMT 及腎纖維化是DKD 進(jìn)展到ESRD 的主要病理基礎(chǔ)和共同途徑，然而目前針對(duì)DKD的治療方式在抑制EMT、抗纖維化方面效果有限。如何有效抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT 及腎纖維化，從而阻止和延緩DKD 向終末期腎病發(fā)展，是目前亟待解決的難題。

腎小管上皮細(xì)胞EMT 在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用［9-10］，而抑制EMT 可以在一定程度上延緩腎纖維化進(jìn)展。在EMT 過程中，上皮細(xì)胞的遷移、侵襲、抗凋亡能力增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加劇腎間質(zhì)細(xì)胞纖維化，嚴(yán)重危害腎臟功能［11］。E-cadherin作為細(xì)胞黏附連接的中心成分，是維持上皮細(xì)胞完整性所必需的。α-SMA是肌纖維成熟細(xì)胞表達(dá)的一個(gè)特征蛋白，在腎組織中可直接反映纖維化程度［12］。Fibronectin 是腎纖維化中一種主要的ECM 成分，其合成增加會(huì)促進(jìn)ECM積聚，加快腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展［13］。腎EMT常以E-cadherin表達(dá)量降低，α-SMA、Fibronectin 等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)量升高等為主要特征［14-16］。泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它是泛素分子在一系列酶的作用下，與靶蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的修飾過程。E3 泛素連接酶MARCH7能夠調(diào)控E-cadherin 和β-catenin的表達(dá)。在卵巢癌中，USP7通過逆轉(zhuǎn)MARCH7自身的泛素化，并穩(wěn)定MARCH7，從而介導(dǎo)E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá)［17］。TGF-β可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生，在乳腺上皮細(xì)胞中，野生型p53可以調(diào)控TGF-β信號(hào)產(chǎn)生的EMT［18］，而E3 泛素連接酶Rffl 可通過使MDM2 變得穩(wěn)定來促進(jìn)p53的降解［19］。Rffl 還可通過PRR5L降解促進(jìn)mTORC2介導(dǎo)的PKC-δ磷酸化從而影響肺纖維化進(jìn)展［7］。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平降低，F(xiàn)ibronectin、α-SMA表達(dá)水平升高，而Rffl 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，提示Rffl 高表達(dá)具有一定的抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生纖維化的作用。

SGLT-2 抑制劑是一種不依賴胰島素水平的新型降糖藥，除降糖作用外，它還具備降低血壓、改善腎小球高濾過、減少蛋白尿、改善氧化應(yīng)激、抑制炎癥等腎臟保護(hù)作用［20-21］。對(duì)18周的單側(cè)腎切除db/db小鼠進(jìn)行4 周達(dá)格列凈治療，腎臟TGF-β1、纖溶酶原激活物抑制物1、Ⅳ型膠原以及Fibronectin的表達(dá)均顯著降低［22］。研究表明，達(dá)格列凈可以通過抑制高糖毒性，進(jìn)而降低O-GlcNAc糖基化修飾和減少腎小管缺氧［23］或抑制STAT1/TGF-β1通路激活［24］，從而改善腎小管間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果顯示，與高糖組相比，低劑量達(dá)格列凈+高糖組及高劑量達(dá)格列凈+高糖組中E-cadherin 表達(dá)水平均升高，F(xiàn)ibronectin、α-SMA表達(dá)水平均降低，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，提示達(dá)格列凈具有抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生纖維化的作用。

TGF-β1在EMT 和組織纖維化中起重要調(diào)節(jié)作用，可以正向調(diào)控EMT，是腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化的重要細(xì)胞因子［25］。高血糖會(huì)誘導(dǎo)激活DKD中STAT1和TGF-β1，并參與腎小管間質(zhì)纖維化的過程［24］。抑制STAT1可以抑制肝纖維化的進(jìn)展［26］，此外，STAT信號(hào)通路在腎纖維化中起著至關(guān)重要的作用，激活STAT 可誘導(dǎo)EMT 并導(dǎo)致腎損害緩解［27］。本研究表明，高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中STAT1、TGF-β1的表達(dá)水平升高，過表達(dá)Rffl后STAT1、TGF-β1表達(dá)水平降低，這表明在腎小管上皮細(xì)胞HK-2中E3泛素連接酶Rffl對(duì)STAT1/TGF-β1通路具有一定的抑制作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈同樣可逆轉(zhuǎn)STAT1、TGF-β1 的表達(dá)水平，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，這表明達(dá)格列凈改善EMT的作用可能與抑制高血糖誘導(dǎo)的STAT1/TGF-β1通路相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)格列凈可緩解高血糖條件下腎小管上皮細(xì)胞EMT和纖維化，并抑制了促纖維化因子STAT1和TGF-β1的表達(dá)。本研究初步探索達(dá)格列凈對(duì)DKD 腎小管上皮細(xì)胞EMT 和纖維化的改善作用及其可能機(jī)制，但詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。