馮 星,盧昌楊,鄧亞飛,吳佳穎,苑君君,賀紹君,辛洪雷,劉德義,張留君

羊口瘡(orf)又稱羊傳染性膿皰病,是由羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)感染主要引起山羊和綿羊的一種急性、高度接觸性、嗜上皮性傳染病,人類以及多種野生動(dòng)物如駱駝、馴鹿等也能夠被ORFV感染[1]。orf在絕大多數(shù)養(yǎng)羊國(guó)家均有分布和流行,如中國(guó)、美國(guó)、印度、新西蘭、澳大利亞等,給世界養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-3]。本病主要是侵害6月齡以下的羔羊,患病羔羊在舌面、齒齦、口唇、鼻鏡等部位常出現(xiàn)丘疹、膿皰、潰爛、結(jié)痂等臨床癥狀,導(dǎo)致其吸吮乳汁及采食困難,營(yíng)養(yǎng)攝入不足而免疫力低下,常繼發(fā)多種病原微生物混合感染,因此羔羊病死率可高達(dá)20%-50%。另外,ORFV對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力,并能逃避宿主免疫應(yīng)答而引發(fā)持續(xù)性感染,一旦進(jìn)入羊群將很難被徹底清除掉,這也是其造成更加嚴(yán)重危害的重要原因[4-5]。

ORFV是痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)的重要成員,具有包膜,基因組為一條雙股線狀DNA分子,全長(zhǎng)140 kb左右。F1L基因處于ORFV基因組的中段區(qū)域,所編碼的F1L囊膜蛋白在病毒入侵宿主細(xì)胞、基因組DNA復(fù)制及病毒粒子成熟等過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。此外,F1L蛋白還可介導(dǎo)宿主機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)機(jī)體病毒中和抗體生成,是研發(fā)ORFV亞單位疫苗的優(yōu)良候選靶標(biāo)抗原分子,同時(shí),由于F1L基因位于ORFV基因組的高度保守區(qū),其不同毒株間F1L基因的一致性超過95%,因此成為病原檢測(cè)與診斷中的理想目標(biāo)基因[7]。干擾素抗性基因(Interferon resistance gene,VIR)位于ORFV基因組的左端,是病毒的主要毒力基因,其編碼產(chǎn)物為一種可抑制干擾素抗病毒活性的雙鏈RNA(ds RNA)結(jié)合蛋白。該蛋白是ORFV的非結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒跨種感染和免疫逃逸等方面均發(fā)揮著重要功能,同時(shí)也不斷遭受著來(lái)自宿主的免疫壓力,在對(duì)orf進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和遺傳演化分析時(shí),VIR基因常常被選為靶基因[8-9]。

在我國(guó),幾乎所有養(yǎng)羊省份均有orf發(fā)生與流行情況的報(bào)道。近年來(lái),隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的興起,我國(guó)各地羊場(chǎng)orf的發(fā)生頻度不斷上升,羊群經(jīng)常呈暴發(fā)性流行,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也威脅著人類的生命健康[10]。雖然針對(duì)orf進(jìn)行了較多的研究,但國(guó)內(nèi)目前仍缺乏可供利用的能防治該病的商品化疫苗,也尚無(wú)有效的抗ORFV藥物和療法[11]。因此,適時(shí)開展orf流行病學(xué)調(diào)查研究,尤其是病毒早期感染階段的檢測(cè)與診斷及病毒遺傳變異分析,對(duì)防控orf具有重要的意義。安徽省肉羊養(yǎng)殖業(yè)體積龐大,且主要集中在皖北地區(qū)。并且,其養(yǎng)羊業(yè)近年來(lái)仍在迅速發(fā)展,規(guī)模化羊場(chǎng)的數(shù)量持續(xù)增加,orf現(xiàn)已成為安徽養(yǎng)羊業(yè)的主要傳染病之一。然而,當(dāng)前安徽省orf流行狀況及病原變異情況并不十分清楚。因此,本研究基于ORFVF1L基因建立了一種快速、特異、靈敏的SYBR Green I嵌合熒光染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對(duì)從皖北地區(qū)羊場(chǎng)采集的疑似orf羊臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),并比較、分析陽(yáng)性病料中ORFVVIR基因的遺傳變異情況,揭示病毒的分子遺傳演化規(guī)律,為生產(chǎn)實(shí)踐中orf的防控和治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和病料 山羊痘活疫苗、雞痘活疫苗均購(gòu)自哈藥集團(tuán)。感受態(tài)細(xì)胞DH5-購(gòu)自上海唯地生物。168份疑似orf羊臨床樣本(唇部痂皮、口拭子、血清等)于2021-2022年采集自安徽省皖北地區(qū)的20個(gè)規(guī)模化羊場(chǎng),并保存在動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80 ℃)中備用。

1.2 主要試劑和儀器 病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和Taq Master Mix購(gòu)自上海生工公司;DNA Marker、pMD19-T載體及SYBR Green I Premix Taq購(gòu)自Takara公司。組織病料研磨儀購(gòu)自QIAGEN公司;超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Scientific公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 下載GenBank中發(fā)布的ORFV基因組序列,同源比對(duì)后使用Primer 5.0軟件在序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物,分別用于SYBR Green I qPCR(qF1L-F/R)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建(F1L-F/R)和全長(zhǎng)VIR基因擴(kuò)增(VIR-F/R),引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer sequences

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建和制備 提取ORFV陽(yáng)性樣本中的病毒基因組DNA,并作為模板使用F1L-F/R引物PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)F1L基因,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。產(chǎn)物回收后連接至pMD19-T 載體,轉(zhuǎn)化入DH5-感受態(tài)細(xì)胞中,涂板過夜培養(yǎng)后挑取單克隆并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。將PCR鑒定陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,并同時(shí)送檢測(cè)序。對(duì)構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒保存,并根據(jù)測(cè)量濃度換算其拷貝數(shù)。

1.5 SYBR Green I qPCR檢測(cè)方法的建立

1.5.1 反應(yīng)條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I嵌合熒光法,以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。以能得到較小的閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)、較高的熒光值、溶解曲線單一且特異為標(biāo)準(zhǔn),分別對(duì)SYBR Green I Premix Taq酶濃度、引物濃度、退火溫度、擴(kuò)增體系等進(jìn)行摸索和優(yōu)化。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分別以不同拷貝數(shù)(1.0×102～1.0×109copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,以質(zhì)粒拷貝數(shù)為X軸,Ct值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 特異性試驗(yàn):用已建立的ORFV SYBR Green I qPCR方法檢測(cè)山羊痘和雞痘疫苗毒株的核酸,并設(shè)立陰性對(duì)照,以驗(yàn)證其特異性。

敏感性試驗(yàn):將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,然后作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和普通PCR擴(kuò)增,計(jì)算兩種方法所能檢出的最低模板拷貝數(shù),并同時(shí)對(duì)其敏感性進(jìn)行比較。

重復(fù)性試驗(yàn):用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,以相同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn);選取3個(gè)不同濃度(104～106copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,分別在同等條件下進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次,進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn);通過計(jì)算變異系數(shù)對(duì)熒光定量PCR方法的組內(nèi)及組間重復(fù)性進(jìn)行分析。

1.6 臨床樣本的檢測(cè) 將采集的168份臨床樣本處理后提取DNA作為模板,用建立的ORFV SYBR Green I qPCR和普通PCR法分別檢測(cè),比較、分析陽(yáng)性檢出結(jié)果。

1.7 陽(yáng)性臨床樣本中ORFVVIR全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增、測(cè)序和遺傳演化分析 使用表1中的VIR-F/R引物,PCR擴(kuò)增陽(yáng)性臨床樣本中ORFV的VIR全長(zhǎng)基因,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生工公司測(cè)序?；谝褱y(cè)序樣本毒株VIR基因及GenBank中已收錄參考ORFV毒株(見表2)VIR基因的全長(zhǎng)核苷酸序列,用MEGA 7.0軟件構(gòu)建ORFV毒株間的遺傳進(jìn)化樹(Neighbor-Joining樹,1 000 bootstrap),并用DNA Star 7.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比較和分析。

表2 參考毒株信息Tab.2 Information on reference strains

2 結(jié) 果

2.1 重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19T-F1L的制備結(jié)果 重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)篩選優(yōu)化,確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR 最佳反應(yīng)體系為10 μL:SYBR Green I Premix Taq酶4 μL,上、下游引物qF1L-F/R(20 μmol/L)各0.5 μL,去離子水4 μL,模板DNA 1 μL。最佳反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 60 s;95 ℃ 5 s,61 ℃ 15 s,共計(jì)循環(huán)40次;反應(yīng)結(jié)束后PCR儀自動(dòng)生成融解曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果 使用已優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件,以8個(gè)連續(xù)梯度濃度(102～109copies/μL)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增,并以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X軸),Ct值為縱坐標(biāo)(Y軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,不同濃度質(zhì)粒模板PCR擴(kuò)增曲線間距均勻,拷貝數(shù)與Ct值保持良好線性關(guān)系:y=-3.393x+40.698,相關(guān)系數(shù)(R2)=0.994,擴(kuò)增效率(E%)=95.62%(圖1)。熔解曲線結(jié)果顯示,不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板擴(kuò)增均為單一波峰,無(wú)引物二聚體產(chǎn)生,融解溫度88.5 °C左右,且所有波峰基本重合,陰性對(duì)照無(wú)波峰(圖2),表明PCR擴(kuò)增中未被污染,試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度高。

圖2 ORFV熒光定量PCR熔解曲線Fig.2 Melting curve for qPCR of ORFV

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 特異性檢測(cè)結(jié)果 采用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)山羊痘、雞痘疫苗毒提取的DNA進(jìn)行檢測(cè),均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,且陰性對(duì)照也無(wú)擴(kuò)增曲線,而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及ORFV陽(yáng)性樣本均有良好擴(kuò)增(圖3),表明本試驗(yàn)方法特異性較強(qiáng)。

圖3 ORFV熒光定量PCR特異性擴(kuò)增曲線Fig.3 ORFV PCR-specific amplification curve

2.4.2 敏感性檢測(cè)結(jié)果 以7個(gè)梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(100～106copies/μL)為模板進(jìn)行敏感性檢測(cè)。結(jié)果顯示,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)下限為101copies/μL,而常規(guī)PCR法檢測(cè)下限為103copies/μL,本次建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法敏感性優(yōu)于常規(guī)PCR,檢測(cè)結(jié)果可信度更高。

2.4.3 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)3個(gè)不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(104～106copies/μL)的檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的批內(nèi)擴(kuò)增變異系數(shù)為0.44%～1.14%,批間擴(kuò)增變異系數(shù)為2.82%～3.16%(表3),表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值Tab.3 Ct value of SYBR Green Ⅰ real-time fluorescence qPCR

2.5 臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果 使用所建立的ORFV SYBR Green I qPCR方法對(duì)168份采集自安徽省皖北地區(qū)不同羊場(chǎng)的疑似orf臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),其ORFV總體陽(yáng)性率為37.5%(63/168),其中山羊?yàn)?8%(28 /100),綿羊?yàn)?1.5%(35/68)。

2.6 ORFVVIR基因的進(jìn)化樹分析結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序,共得到52條陽(yáng)性樣本中ORFV的全長(zhǎng)VIR基因序列,其中山羊源和綿羊源分別為21條和31條。將其與GenBank收錄的15株國(guó)內(nèi)外ORFV參考毒株的完整VIR基因一起作遺傳演化分析。進(jìn)化樹分析顯示,已構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹可分為兩個(gè)主要分支,其中本次試驗(yàn)的21株山羊源毒株與8株國(guó)內(nèi)外山羊源參考毒株(AH1704、AH1604、Nantou、FJ-YT2015、ShanX、SX3、OV-SA00、SP45)和1株人源參考毒株(hChi17.2017)位于一個(gè)大分支,而本次試驗(yàn)的31株綿羊源毒株與7株國(guó)內(nèi)外綿羊源參考毒株(XinJiang、GanSu、NA1、OV-HN3、Hyderabad、NZ2、IRFHVIR10)、1株人源參考毒株(hMbu15)和1株疫苗毒株(OV-V)位于另一個(gè)遺傳距離較遠(yuǎn)的獨(dú)立分支上(圖4)。

●:2021-2022年陽(yáng)性樣品分離株圖4 基于ORFV-VIR基因序列以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)Fig.4 Phylogenetic tree (NJ tree) constructed with the proximity method based on the ORFV-VIR gene sequence

2.7 ORFVVIR基因的核苷酸及氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果 核苷酸和氨基酸序列多重比對(duì)分析顯示,本次試驗(yàn)的52株陽(yáng)性樣本毒株的VIR基因編碼183個(gè)氨基酸,均未出現(xiàn)堿基對(duì)的增添和缺失,其相互間核苷酸和所推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為95.8%～100.0%和93.5%～100.0%,與參考毒株VIR基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為95.1%～100.0%和91.3%～100.0%(表4)。此外,本次測(cè)得的21株山羊源陽(yáng)性樣本毒株VIR基因間核苷酸和所推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為98.6%～100.0%和98.4%～100.0%,與參考毒株VIR基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為95.3%～100.0%和92.9%～100.0%,其中與國(guó)內(nèi)山羊源AH1704、Nantou、SX3毒株同源性最高,氨基酸同源性均為98.9%～100.0%,而本次測(cè)得的31株綿羊源陽(yáng)性樣本毒株VIR基因間核苷酸和所推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為99.5%～100.0%和99.5%～100.0%,與參考毒株VIR基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為95.1%～100.0%和91.8%～100.0%,其中與國(guó)內(nèi)綿羊源Xinjiang、Gansu、Na1、OV-HN3同源性最高,核苷酸序列和氨基酸序列均為99.5%～100.0%,疫苗株與綿羊源陽(yáng)性樣本分離株同源性更高,氨基酸序列同源性為95.1%～95.7%(表4)。對(duì)VIR基因進(jìn)一步分析顯示,所有山羊源毒株VIR基因的氨基酸序列與綿羊源毒株存在較多突變,其位點(diǎn)主要分布在第14、17、24、47、97、101、103、122、124、135、140、154和169位氨基酸處。另外,人源毒株VIR基因氨基酸突變位點(diǎn)與所有山羊源和綿羊源毒株均存在較大差異(圖5)。

圖5 VIR基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析Fig.5 Analysis of amino acid sequences derived from the VIR gene

表4 52株ORFV分離株和國(guó)內(nèi)外參考分離株VIR核苷酸和氨基酸序列同源性分析(%)Tab.4 Analysis of VIR nucleotide and amino acid sequence identities (%) of the 52 Anhui ORFV isolates and the reference ORFV isolates from China and abroad

3 討 論

orf是一種廣泛分布于世界上各個(gè)養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)的人獸共患傳染病。本病在成年羊群中發(fā)生較少且多呈隱性經(jīng)過,但在羔羊群中具有較高的發(fā)病率和死亡率,并可引發(fā)多種病原混合感染或繼發(fā)感染,同時(shí)造成持續(xù)性感染,不僅降低羊場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益,而且威脅從業(yè)人員身體健康[12-13]。orf現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響世界養(yǎng)羊生產(chǎn)的主要病毒性傳染病之一,也是阻礙我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要不利因素。目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)orf的有效藥物和治療方法,疫苗免疫接種是預(yù)防和控制該病的重要措施,但是滅活疫苗因誘導(dǎo)中和抗體能力低、持續(xù)時(shí)間短而保護(hù)效果較差,弱毒疫苗又因容易出現(xiàn)毒力反強(qiáng)而存在散毒風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)至今還沒有可供利用的商品化orf疫苗,疫苗的研制仍停留在實(shí)驗(yàn)室評(píng)估階段,并且不同地區(qū)流行的毒株還存在一定的遺傳差異,這大大增加了orf的防控難度[14]。因此,及時(shí)地對(duì)該病做出準(zhǔn)確診斷,確定感染毒株的類型,對(duì)受感染羊進(jìn)行隔離與對(duì)癥治療,是控制該病的有效途徑。

目前,病毒分離、電子顯微鏡觀察、血清學(xué)方法、普通PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR、染料法 qPCR等已相繼被用于orf的臨床診斷[15]。但以上方法均存在一定的不足之處,如:操作復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng),只適合檢測(cè)小量樣本;易發(fā)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致特異性降低;敏感性較低,易出現(xiàn)假陰性;易污染而造成假陽(yáng)性;檢測(cè)成本較高,難以滿足規(guī)模化羊場(chǎng)的全面篩查等[6,15-17]。在本次研究中,我們根據(jù)ORFVF1L基因高度保守區(qū)片段設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物,并以構(gòu)建的pMD19T-F1L重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,建立了用于檢測(cè)ORFV DNA的SYBR Green I qPCR方法。所建立的qPCR方法檢測(cè)時(shí)間短;特異性強(qiáng),只能擴(kuò)增出ORFV核酸DNA,與痘病毒科的其它成員如山羊痘和雞痘疫苗毒均無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度高,最低有效檢測(cè)量為10 copies/μL,是普通PCR的100倍;花費(fèi)少,包括樣品前處理在內(nèi),單個(gè)樣本的檢測(cè)費(fèi)用不足10元,從而實(shí)現(xiàn)了在感染早期階段對(duì)ORFV的快速、特異、靈敏和低成本的批量檢測(cè)與診斷。使用該qPCR方法對(duì)從安徽省皖北地區(qū)采集的168份疑似orf臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),病毒總陽(yáng)性率為37.5%(63/168),其中山羊?yàn)?8%(28/100),綿羊?yàn)?1.5%(35 /68)。這些結(jié)果表明,皖北地區(qū)羊群存在ORFV普遍感染現(xiàn)象,應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)orf的監(jiān)測(cè)與防控。建議針對(duì)病毒陽(yáng)性羊群除了嚴(yán)格隔離與對(duì)癥治療外,必要時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行淘汰處理,同時(shí)也應(yīng)避免養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員的感染。

VIR基因是ORFV的主要毒力基因,編碼一種可抑制宿主干擾素抗病毒活性的ds RNA結(jié)合蛋白,參與病毒早期感染,并與病毒跨種感染及免疫逃逸密切相關(guān)[9]。在對(duì)orf進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及抗原性分析時(shí),VIR基因常被作為研究對(duì)象。為了進(jìn)一步明確安徽省皖北地區(qū)ORFV流行毒株的分子遺傳特征。本研究對(duì)陽(yáng)性樣本中ORFV全長(zhǎng)VIR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,得到了52株病毒的完整VIR基因序列,其中山羊源21株,綿羊源31株。進(jìn)化樹分析顯示,21株山羊源毒株與8株國(guó)內(nèi)外山羊源參考毒株和1株人源參考毒株位于同一大分支,而31株綿羊源毒株與7株國(guó)內(nèi)外綿羊源參考毒株、1株人源參考毒株及1株疫苗毒株位于另一獨(dú)立分支,表明不同宿主來(lái)源毒株間其遺傳距離較遠(yuǎn)。序列多重比對(duì)分析顯示,52株病毒分離株VIR基因間DNA及氨基酸序列的同源性分別為95.8%～100.0% 和93.5%～100.0%,明顯低于之前的報(bào)道[18],表明皖北地區(qū)ORFV存在較大程度的遺傳變異。21株山羊源毒株與安徽參考毒株(AH1704)、臺(tái)灣株(Nantou)、山西株(SX3)同源性較高,氨基酸同源性均在98.9%以上。31株綿羊源毒株與國(guó)內(nèi)新疆株(Xinjiang)、甘肅株(GanSu)、桂林株(Na1)、廣東株(OV-HN3)同源性較高,氨基酸同源性為99.5%～100%。此外,31株綿羊源毒株與美國(guó)疫苗株OV-V處于同一分支,并且其氨基酸同源性也較高(95.1%～95.7%),而該疫苗株并未在我國(guó)注冊(cè)和批準(zhǔn)使用。根據(jù)以上結(jié)果,推測(cè)安徽皖北地區(qū)orf流行可能與羊群相互頻繁調(diào)運(yùn)或引種不當(dāng)有關(guān),同時(shí)也再次提示弱毒疫苗可能存在返毒、散度等安全風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)加強(qiáng)調(diào)運(yùn)和引種過程中的檢疫。進(jìn)一步氨基酸序列分析顯示,所有山羊源、綿羊源和人源毒株的VIR基因氨基酸序列間存在較大差異,主要突變位點(diǎn)位于第14、17、24、47、97、101、103、122、124、135、140、154和169位等氨基酸處,推測(cè)這些氨基酸位點(diǎn)可能與宿主適應(yīng)性相關(guān),這些變化可能是病毒在跨種感染過程中為了適應(yīng)不同宿主或遭受不同選擇壓力而引起的,這些位點(diǎn)的功能有待于進(jìn)一步的研究驗(yàn)證[19-20]。值得注意的是,人類宿主來(lái)源的兩株ORFV分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與綿羊、山羊宿主來(lái)源的分離株氨基酸同源性較低,表明人類宿主的毒株變異情況可能更為復(fù)雜。

總之,orf作為嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)可持續(xù)發(fā)展及人類健康的重要疫病之一,其病原致病機(jī)制不明、病毒變異情況復(fù)雜、缺乏有效疫苗與治療方法,快速診斷和確定病原類型是控制該病的有力措施。本研究基于ORFVF1L基因建立了一種快捷、特異、靈敏、低成本的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,不僅適用于對(duì)ORFV的檢測(cè)和診斷,還能對(duì)臨床檢測(cè)樣本中病毒含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量,在為ORFV早期監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供有效手段的同時(shí),也為未來(lái)開展ORFV實(shí)驗(yàn)室研究等奠定了良好基礎(chǔ)。對(duì)安徽省皖北地區(qū)羊場(chǎng)ORFV流行毒株VIR基因的遺傳變異分析,有助于揭示病毒的分子遺傳演化規(guī)律,明確感染毒株的類型,以便采取針對(duì)性防治措施,也可為病毒致病機(jī)制研究及有效疫苗設(shè)計(jì)開發(fā)提供理論參考。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:馮星,盧昌楊,鄧亞飛,等.羊口瘡病毒SYBR Green I qPCR方法建立及VIR基因的遺傳演化分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):772-779. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.084