吳晶晶,陳宏彬,林 琦,張炎華,鄢育青,翁育偉

禽流感是指由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)在家禽或野禽中傳播引起的一類傳染性疾病,但部分亞型也能跨越種屬屏障和受體差異性,引起人類發(fā)病。目前已發(fā)現(xiàn)人感染AIV并導(dǎo)致高致死率的主要亞型為H5亞型和H7亞型。根據(jù)AIV致病力的大小,可將AIV分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。H5N1 HPAIV于1996年在廣東省鵝群中成功分離A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1),并于1997年在香港感染人類而引發(fā)疫情[1]。由于其對禽類養(yǎng)殖行業(yè)的巨大沖擊,以及人類感染的高發(fā)病率和高死亡率,H5亞型AIV引發(fā)了全球社會廣泛關(guān)注。WHO/OIE/FAO等國際組織根據(jù)HA基因的進(jìn)化程度,將H5亞型分為Clade 0～9主干支,并進(jìn)一步分為多個亞系分支[2],其中Clade 2.3.4.4為國內(nèi)近些年H5亞型的主要流行分支[3-4]。2014年,中國報道了歸屬于Clade 2.3.4.4進(jìn)化分支的HPAIV H5N6,并逐漸取代H5N1 AIV流行株,在中國東部和南部地區(qū)家禽中引起廣泛傳播[5-6]。隨后幾年,Clade 2.3.4.4 新型H5N6或H5N8重組AIV不僅在亞洲,也在歐洲、美洲等全球范圍內(nèi)的家禽及野禽中傳播,截止2021年5月,全球已報道29例經(jīng)實驗室確認(rèn)的人感染該進(jìn)化分支病例,包括了至少16例死亡病例[7]。福建省于2017年12月報道了人感染HPAIV H5N6(A/Fujian-Sanyuan/ 21099/2017-like(H5N6)),序列分析顯示該病毒由不同地區(qū)的HPAIV H5N8、H5N6及 LPAIV H6N6基因重組而成[8],提示環(huán)境中不同亞型AIV可重組成HPAIV,并存在感染人類的可能性。為進(jìn)一步了解福建省新型H5N6 AIV的流行特點,本研究對福建省禽類外環(huán)境H5亞型AIV的HA基因及NA基因進(jìn)行分析,為疾病預(yù)防和控制提供相應(yīng)參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 根據(jù)《福建省職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測實施方案(2012版)》的采樣要求,選取本實驗室保存的2018-2019年福建省禽類外環(huán)境標(biāo)本。標(biāo)本分別來自福建省設(shè)立的6個地市監(jiān)測點(福州、廈門、泉州、三明(梅列區(qū))、漳州(漳浦縣)、南平(建甌市);樣本的采集場所為:城鄉(xiāng)活禽市場、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(戶)、家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)和家禽屠宰加工廠;樣本類型為:籠具表面擦拭標(biāo)本、宰殺或擺放禽肉案板表面擦拭標(biāo)本、糞便標(biāo)本、清洗禽類的污水、禽類飲用水及其他等6類環(huán)境標(biāo)本。

1.2 標(biāo)本核酸檢測 根據(jù)“中國流感信息檢測系統(tǒng)”中的禽類外環(huán)境標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果,從本實驗保存的2018-2019年福建省禽類外環(huán)境標(biāo)本中篩選出H5單陽性標(biāo)本,將篩選的標(biāo)本凍融后充分振蕩,使用天隆GeneRotex系列全自動核酸提取儀進(jìn)行核酸提取,并使用H5亞型分型核酸測定試劑盒(購自上海之江),采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行H5亞型AIV的復(fù)核檢測,并挑選出Ct值小于30的樣本。

1.3 基因序列擴(kuò)增與測序 使用甲型流感通用引物(Uni-12/Inf1:5′-GGGGGGAGCAAAAGCAGG-3′;Uni-12/Inf3: 5′-GGGGGGAGCGAAAGCAGG-3′;Uni-13/Inf1: 5′-CGGGTTATTAGTAGAAACAAGG-3′)進(jìn)行RT-PCR靶向擴(kuò)增AIV HA和NA基因片段,反應(yīng)參數(shù)為:45 ℃ 60 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,44 ℃ 30 s,68 ℃ 3 min,5個循環(huán);94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,68 ℃ 3 min,31個循環(huán);68 ℃ 7 min。配置1%瓊脂糖凝膠,電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,并將符合目的條帶大小的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送北京諾禾致源生物信息科技公司進(jìn)行二代測序。使用CLC Genomics Workbench軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。

1.4 HA和NA基因遺傳進(jìn)化和分子特征分析 將本研究獲得的序列與NCBI、GISAID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對,并下載國內(nèi)外環(huán)境、禽類和人相關(guān)的H5和N6基因毒株序列,包括2020年最新被WHO列為H5流感病毒候選的9株Clade 2.3.4.4疫苗株序列:A/duck/Hyogo/1/2016(H5N6)、A/Sichuan/26221/2014(H5N6)、A/gyrfalcon/Washington/41088-6/ 2014(H5N8)、A/chicken/Viet Nam/NCVD-15A59 /2015-like(H5N6)、A/Guangdong/18SF020/2018-like(H5N6)、A/Hubei/29578/2016-like(H5N6)、A/Fujian-Sanyuan/21099/2017-like(H5N6)、A/chicken/Vietnam/RAHO4-CD-20-421/2020-like(H5N6)、A/Astrakhan/3212/2020-like(H5N8)。

使用MEGA 6.0軟件,以基因開放閱讀框為完整序列,采用Maximum Likelihood法繪制HA和NA基因遺傳進(jìn)化樹,分析進(jìn)化特點。使用MegAlign以及MEGA 6.0軟件進(jìn)行重要蛋白位點以及突變位點的分析。使用Net NGlyc 1.0 Server在線軟件分析預(yù)測糖基化位點。

2 結(jié) 果

2.1 H5亞型AIV流行和測序情況 2018年和2019年福建省外環(huán)境AIV標(biāo)本采樣總數(shù)分別為853份和848份:檢出A型流感病毒核酸陽性標(biāo)本334份和352份,A型陽性率分別為39.16%和41.51%;檢出H5單陽性標(biāo)本32份和31份,H5單陽性率分別為3.75%及3.66%。經(jīng)實時熒光定量PCR復(fù)核篩選,選出Ct值小于30的標(biāo)本共15份,再經(jīng)靶向擴(kuò)增,根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶篩選并純化后送測序樣本共12份,送測序標(biāo)本主要來源于城鄉(xiāng)活禽市場。經(jīng)序列拼接分析,分別獲得12株HA基因及NA基因全長,所獲基因測序覆蓋度均為100%。12株HA基因的平均測序深度在3 735.45～30 676.61X,12株NA基因的平均測序深度在3 700.91～60 381.16X,所獲全部序列已上傳至GISAID數(shù)據(jù)庫,登陸號及測序標(biāo)本信息具體見表1。

2.2 序列比對和遺傳進(jìn)化分析 序列比對分析表明,本研究獲得的12株病毒HA基因與數(shù)據(jù)庫中比對的核酸序列最高一致性在98.59%～99.89%,分別與廣東、福建、江西和湖南省家禽及環(huán)境樣本分離的H5N6毒株一致性最高;12株病毒NA基因與數(shù)據(jù)庫中比對的核苷酸序列最高一致性在98.19%～99.85%,分別與廣東、福建、江西和江蘇省家禽及環(huán)境樣本分離的H5N6和H6N6毒株一致性最高,H5基因和N6基因的序列比對結(jié)果詳見表2。

表2 2018-2019年福建省禽類外環(huán)境送測序樣本序列比對結(jié)果Tab.2 Sequence alignment results of avain external environment sequencing samples in Fujian Province from 2018 to 2019

表3 H5基因和N6基因分子特征和關(guān)鍵氨基酸位點分析Tab.3 Molecular characteristics and key amino acid mutations of the H5 and N6 genes

構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析表明,2018—2019年福建省外環(huán)境H5亞型AIV均屬于Clade 2.3.4.4h進(jìn)化分支(圖1),進(jìn)一步可分為2個亞系:A/Env/Fujian/C18209018/2018(H5N6)單獨為一個亞系(h2),其余11株同屬于一個亞系(h1)。N6基因主要歸屬于歐亞譜系的H5N6和H6N6進(jìn)化分支:10株屬于H5N6進(jìn)化分支,其余2株A/Env/Fujian/C19036006/2019(H5N6)以及A/Env/Fujian/C19035003/2019(H5N6)屬于H6N6進(jìn)化分支(圖2)。

▲: represent strains from Fujian Province; ●: represent vaccine strains圖1 2018-2019年福建省禽流感病毒HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the HA genes of avian influenza virus in Fujian Province, 2018-2019

▲: represent strains from Fujian Province圖2 2018-2019年福建省禽流感病毒NA基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the NA genes of avian influenza virus in Fujian Province, 2018-2019

2.3 蛋白分子特征分析 12株H5亞型AIV 的HA蛋白裂解位點均為RERRRKR↓GLF,且多個堿性氨基酸位于該裂解位點處,是HPAIV的分子特征。所有毒株在HA蛋白受體結(jié)合位點Q226及G228(H3 計數(shù))均未發(fā)生突變,保留了病毒對禽類受體SAα2, 3-Gal親和力的特性[9-10];所有毒株在HA蛋白均發(fā)生S133A及T156A突變,研究表明該突變位點可以增強病毒對人類受體SAα2, 6-Gal的親和力[9-10];所有毒株在HA蛋白126E發(fā)生氨基酸缺失,該缺失突變已被報道是歸屬于Clade 2.3.4.4h的H5N6 AIV常見的突變位點[5,11]。其余氨基酸突變及其生物學(xué)功能見表2。

HA蛋白糖基化位點分析顯示,有10株病毒的糖基化位點相同,分別在11、23、54、124、164、192、285、482、541位,HA蛋白常見的154位糖基化位點(-NDTY)由于T156A突變而消失;而124位糖基化位點(-NHTS)由于126E缺失突變而新增。另外2株病毒(C19209014及C19036006)分別在214位(-NRSQ)以及235位(-NDTI)也由于氨基酸突變產(chǎn)生新的糖基化位點。

NA蛋白分子特征分析顯示,11株NA蛋白在頸部59-69位發(fā)生11個氨基酸缺失突變,1株NA蛋白(C19209010)頸部59-68位發(fā)生10個氨基酸缺失突變,研究發(fā)現(xiàn)NA蛋白頸部缺失可提高和增強禽類、人類病毒感染的毒力;常見耐藥位點274及292位(N2計數(shù))均未出現(xiàn)突變,提示未改變毒株對奧司他韋(oseltamivir)和扎那米韋(zanamivir)抗流感藥物的敏感性[8,12]。

3 討 論

資料顯示,2013-2017年福建省H5亞型AIV的平均陽性率為4.24%[13],與2018年、2019年H5亞型的陽性率較為相近,說明H5亞型AIV在福建省禽類環(huán)境如城鄉(xiāng)活禽市場等一直長期流行。本研究通過比對HA及NA基因序列發(fā)現(xiàn),H5基因、N6基因分別與福建省臨近省份的序列相近,相似性在98.19%～99.89%,包含H5N6和H6N6的基因序列,顯示出中國南方地區(qū)的序列在地域上具有一定高度同源性。

2017年,Lee等[14]根據(jù)H5亞型AIV的進(jìn)化情況將HA基因劃分為4個進(jìn)化小組:Group A～Group D,其中亞洲地區(qū)的主要進(jìn)化分支為Group C,且大部分感染人類的H5N6 AIV來源于該分支[15-16]。2020年1月,根據(jù)WHO/OIE/FAO等國際組織對H5亞型AIV系統(tǒng)發(fā)育的最新命名規(guī)則,Clade 2.3.4.4 H5Nx病毒HA基因被劃分為8個亞進(jìn)化分支(Sub-Clade):Clade 2.3.4.4a～2.3.4.4h,將原先的Group C細(xì)分為Clade 2.3.4.4d～2.3.4.4h,其中Clade 2.3.4.4h指主要來源于中國的野禽和家禽、老撾和越南家禽的H5亞型AIV,并且大多數(shù)HA基因與A/Guangdong/18SF020/2018相比,其氨基酸的差異小于10個氨基酸[17]?；蜻M(jìn)化分析顯示,本研究所測12株H5亞型AIV均是屬于Clade 2.3.4.4h進(jìn)化分支,與江蘇、廣東等中國南方地區(qū)同一時期家禽相關(guān)外環(huán)境H5亞型AIV的進(jìn)化分支一致,該進(jìn)化分支也是中國大陸南方地區(qū)近年來的主要流行分支[18-19]。在N6基因方面,有2株來源于H6N6進(jìn)化分支,與另外10株歸屬于H5N6進(jìn)化分支相獨立開來,提示N6基因在進(jìn)化上具有多樣性,H5N6 AIV與H6N6 AIV曾發(fā)生重組。多項研究表明,不同亞型的LPAIV可通過重組成HPAIV,因此加強AIV的重組監(jiān)測尤為重要[8,19-22]。

HA蛋白在識別宿主細(xì)胞的唾液酸受體,細(xì)胞膜融合,逃脫宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視以及病毒粒子包裝和出芽等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[23-24]。HA蛋白分子特征分析表明,本研究所測12株HA蛋白均為RERRRKR↓GLF裂解位點,包含多個堿性氨基酸,提示福建省環(huán)境中存在H5亞型HPAIV,該結(jié)果與福建省2017年的相關(guān)研究一致[8]。受體位點分析顯示,2018—2019年福建省H5亞型為禽源受體,但常見重要蛋白位點S123P、S133A、I151T、T156A突變可增強病毒與人源受體的親和力。在糖基化位點分析方面,有研究表明HA蛋白154位糖基化位點的缺失可使病毒更耐受高溫環(huán)境,增強與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力,提高了H5Nx毒株在自然界的流行能力[25],因此T156A突變導(dǎo)致154位糖基化位點缺失是Clade 2.3.4.4 H5Nx毒株的常見分子特征,也是該分支成為福建等中國南方地區(qū)主要流行株的原因之一。此外,HA蛋白新增124位、214位及235位糖基化位點,還尚未有研究能解釋新增的糖基化位點對HA蛋白功能的影響。NA蛋白分子特征分析顯示,本研究發(fā)現(xiàn)有一株NA蛋白頸部缺失10個氨基酸,不同于NA蛋白頸部常見的11個氨基酸缺失突變?，F(xiàn)有研究表明,NA蛋白頸部11個氨基酸缺失突變可增強病毒對人類受體親和力以及對禽類感染的毒力[1,26],但還尚未有報道比較頸部位置缺失不同數(shù)量而導(dǎo)致氨基酸功能的具體差異,不同數(shù)量氨基酸的缺失還是否會影響病毒傳播能力和致病性還有待實驗研究。

隨著2013-2017年國內(nèi)多次暴發(fā)人感染HPAIV H7N9疫情,政府等相關(guān)部門出臺了嚴(yán)格管控措施,2017年禽類開始大規(guī)模的接種H5/H7雙價疫苗,監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示福建省外環(huán)境中H7亞型的陽性率在2018年之后顯著降低[27],且2019年后國內(nèi)未見有相關(guān)人感染H7N9病例的報道,不同研究也提示雙價疫苗的使用在抑制H7N9 AIV人群中傳播方面有顯著的效果[28-29]。但在H5亞型方面,由于H5亞型在我國活禽市場長時間流行并持續(xù)發(fā)生變異,已出現(xiàn)由H5N1、H6N6及H9N2內(nèi)部基因新型重組HPAIV H5N6,且流行株和疫苗株抗原發(fā)生偏離[30],可能降低雙價疫苗對H5亞型AIV的保護(hù)效應(yīng)。

根據(jù)本研究H5亞型的監(jiān)測數(shù)據(jù)以及12株AIV H5、N6基因分子特征分析結(jié)果,福建省城鄉(xiāng)活禽市場等禽類環(huán)境中仍流行一定數(shù)量的HPAIV H5N6。目前福建省禽類市場主要流行的AIV亞型為H9亞型[27],LPAIV可為H5亞型AIV提供內(nèi)部基因,重組而成新型HPAIV H5N6,并且可能持續(xù)進(jìn)化和變異,有潛在感染人類的風(fēng)險。人感染AIV的主要途徑是通過人與禽類或人與禽類相關(guān)環(huán)境的接觸[31],因此對禽類外環(huán)境的監(jiān)測和序列研究對人類感染AIV的防控意義重大。本研究通過分析福建省外環(huán)境中的H5亞型AIV序列的分子特征,也可對外環(huán)境AIV的防控和人感染AIV的研究提供一定參考和理論依據(jù)。

利益沖突:無

引用本文格式:吳晶晶,陳宏彬,林琦,等.2018-2019年福建省禽類外環(huán)境H5亞型禽流感病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(8):750-757. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.081