張明宇 劉曉霖 孔祥傳 畢 靜 魯欣怡 潘國軍

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016

泰山白首烏，也叫泰山何首烏，是泰安道地藥材。目前，對白首烏的研究主要集中在其化學(xué)成分和藥理作用，如抗腫瘤、抗衰老等方面［1］。但對其根際微生物及其次級代謝產(chǎn)物的研究卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道［2］。

苯并吡喃酮及其衍生物屬于有機(jī)雜環(huán)化合物［3-4］，為白色晶體或結(jié)晶性的粉末，又稱香豆素，廣泛分布于藥用植物中。由于其種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其生理功能多樣，如抗凝血、抗炎、抗癌癥［5］、抗艾滋病毒［6］、抗腫瘤、治療皮膚病等［7-8］，已廣泛應(yīng)用于人們的生活中［9］。此外，香豆素本身也是一種香料，廣泛分布于曲霉菌、草木犀、香豆、熏衣草和菊蕓香科等植物界［10］。本文從白首烏的根際土壤中分離得到一株真菌Leptosphaeriasp. CXY48，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到4 種苯并吡喃酮類化合物，通過光譜和理化性質(zhì)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

如前所述，本文以泰山白首烏根際土壤真菌為研究對象，篩選獲得天然菌株Leptosphaeriasp.CXY48（圖1），選擇最適的培養(yǎng)條件，通過大批發(fā)酵獲得次級代謝產(chǎn)物，分離獲得單體化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最后評價其生物活性，為新型抗菌藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)提供新的思路。

圖1 實(shí)驗(yàn)菌株Leptosphaeria sp. CXY48

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與儀器，如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用試劑與儀器以及廠家信息

1.1.2 樣品來源 白首烏根際土壤取自山東省泰山市泰山之上，距地表5 ～ 20 cm的白首烏地下根莖土壤。樣本采集時間為2020年3月1日。

1.1.3 培養(yǎng)基類型 分離培養(yǎng)基：PDA 固體培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP2 培養(yǎng)基，真菌1號培養(yǎng)基，真菌2號培養(yǎng)基，真菌3號培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基，大米培養(yǎng)基；分析培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)菌株 以金黃色葡萄球菌（S.aureusATCC33591） 和 大 腸 埃 希 菌（E.coliATCC25922）進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 在無菌環(huán)境下，采用倍數(shù)稀釋法將泰山白首烏根際土壤懸液（1.0 g/L）并稀釋成10-1、10-2、10-3和10-4g/L 4 個不同濃度。28 ℃，搖床24 h 后，取100 μL 涂布在PDA 和孟加拉紅培養(yǎng)基上，然后在28 ℃下倒置培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的分離與純化 涂布3天后，用接種環(huán)將單個菌株挑出，在培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，分離純化得到單菌落培養(yǎng)基，挑取單菌落3點(diǎn)培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察其形態(tài)。

1.2.3 菌株排重與篩選 將所分離出的單菌落接種到大米培養(yǎng)基，28 ℃靜置發(fā)酵25 d，用等量乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得粗提物，并配制成1.0 g/L 甲醇溶液；根據(jù)形態(tài)特征、HPLC 指紋圖譜分析，排除重復(fù)菌株；以環(huán)丙沙星0.1 g/L 作為陽性對照，測試次級代謝產(chǎn)物（10 μL）的抗菌活性：以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，在37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行倒置培養(yǎng)一夜后，觀察抑菌圈的大小。篩選出5 株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性的菌株，并通過指紋圖譜分析，確定天才菌株為CXY48。

1.2.4 菌株鑒定 將確認(rèn)的CXY48菌株在PDA平板上，倒置培養(yǎng)3 ～ 5 d，并測試ITS保守序列?；诨驕y序的結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，查找同源的序列，選擇有代表性菌株序列展開分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。CXY48 菌株與Leptosphaeriasp. CPP-4 具有高度的同源性，結(jié)合對其形態(tài)特征的分析，鑒定CXY48為小球腔菌屬。

圖2 CXY48菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化與發(fā)酵 選取真菌1號、真菌2號、真菌3號、真菌4號、ISP2、PDB和大米培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，并對培養(yǎng)時間、溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，在28 ℃條件下，大米培養(yǎng)基靜置發(fā)酵30 d最佳。

取-80 ℃冷凍保藏的Leptosphaeriasp. CXY48菌種，無菌條件下，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床活化培養(yǎng)3 d。將活化好的菌種按照1%的接種量接種到滅完菌的大米培養(yǎng)基，共計(jì)140瓶，培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵30 d。

1.2.6 粗提物的富集 發(fā)酵結(jié)束后，用等量乙酸乙酯浸泡一夜，反復(fù)3次浸提，合并有機(jī)相減壓濃縮得到粗提物。將粗提物溶于2 L 乙酸乙酯溶解后，將其倒入分液漏斗中，用1/3 體積自來水萃洗以除水溶性雜質(zhì)，反復(fù)3次；乙酸乙酯相減壓旋蒸得粗提物，用2 L 90%甲醇水溶液溶解后，加入1/3 體積石油醚進(jìn)行脫油處理，反復(fù)3 次，甲醇水溶液濃縮后，得到最終粗提物。

1.2.7 代謝產(chǎn)物分離純化 采用減壓硅膠柱層析技術(shù)，對其進(jìn)行正、反向極性分段，以活性為導(dǎo)向確定分離的組分，并結(jié)合TLC、HPLC、硅膠柱層析和半制備色譜等進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的分離與純化，從而獲得活性單體化合物。

50 g 粗提物利用減壓硅膠柱層以乙酸乙酯：石油醚（v/v）10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1 和0∶1 進(jìn)行階段梯度洗脫，經(jīng)過HPLC 分析合并得到5 個餾分（Fr. 1 ～ 5）。在十八烷基硅膠（ODS）中，餾分Fr. 2（15.7105 g）和餾分Fr. 3（21.1076 g）以甲醇：水（10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、100%）梯度洗脫，餾分Fr. 2 得到7 個亞餾分（Fr.2-1 ～ Fr.2-7）。將亞餾分Fr.2-2（2.8467 g）采用HPLC（50% MeCN/H2O， v/v）得到化合物1（tR7.3 min，7.8 mg）和化合物4（tR10.2 min，24.9 mg）；餾分Fr.3 得到8 個亞餾分（Fr.3-1 ～ Fr.3-8）。將亞餾分Fr. 3-3 采用HPLC（47% MeOH/H2O， v/v）得到化合物2（tR26 min，29.6 mg）和化合物3（tR27 min，9.2 mg）。

2 結(jié) 果

2.1 抑菌活性測試

采用藥敏紙片法測定了化合物1 ～ 4 的抗菌活性，以環(huán)丙沙星（0.1 g/L）為陽性對照，結(jié)果如表1所示。其中，化合物1 和化合物4 對大腸桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）值為3.89和70 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值分別為187和250 μg/mL，結(jié)果如表2所示。

表2 4種化合物抗菌活性評價

表3 化合物1 ～ 4 13C-NMR（100MHz）在CDCl3中的數(shù)據(jù)

表4 化合物1 ～ 41H NMR（400 MHz）在CDCl3中的數(shù)據(jù)

2.2 活性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

將化合物1 ～ 4 用核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）和質(zhì)譜（MS）等進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

化合物1：淡黃色固體，1H NMR 顯示1 個螯合羥基質(zhì)子（δH11.28），1個羥基質(zhì)子（δH7.87），1個單態(tài)芳香族質(zhì)子（δH6.43），1個羥甲基質(zhì)子（δH4.22），1個甲氧基（δH3.88），2個單態(tài)甲基（δH2.11， 1.80），1個雙態(tài)甲基（δH0.93），13C NMR和DEPT 135光譜顯示了1個內(nèi)酯碳基（δ 171.5）、六季（δ 165.4、156.5、149.9、112.2、103.0 和91.9）、2 個甲基（δ 98.2 和71.0）和4 個甲基（δ 56.3、21.2、17.8 和11.2）碳的共振，ESI-MS： m/z 275 ［M+Na］+。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中Fusaraisochromanone 2 一致，此化合物被鑒定為Fusaraisochromanone 2［11］。

化合物2：淡黃色固體，1H NMR 顯示出2 個伯甲基（δH1.07， 2.07）、1 個甲氧基（δH3.86）、1 個亞甲基（δH3.90， 3.80）、2個次甲基（δH3.29， 4.50）和1個芳香質(zhì)子（δH6.43）的信號，13C NMR和DEPT光譜顯示出13 個碳共振，由3 個甲基（1 個氧化）、1 個氧化亞甲基、3 個次甲基（1 個氧化和1 個芳族）和6個非質(zhì)子化碳（1個羰基和5個烯屬）組成，ESI-MS：m/z 275 ［M+Na］+。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中Clearanol Ⅰ一致，此化合物被鑒定為Clearanol I［12］。

化合物3：淡黃色固體，1H NMR顯示兩組密切相關(guān)的信號，比率為5.8∶1，1個芳族甲氧基的存在（δc 56.0； δH3.84），1個單線態(tài)芳甲基（δc 9.8； δH2.00），和1個單線態(tài)芳香質(zhì)子（δc 97.0； δH6.45），結(jié)合紫外光譜，表明是1個等色酮骨架。1H核磁共振剩余的信號光譜為雙峰甲基（δc 16.3； δH1.06）偶聯(lián)到芐型次甲基（δc 35.0； δH3.28）和1個CH2OH基團(tuán)（δc 63.6；δH3.64， 3.72），EI-MS： m/z 269.1023 ［M+Na］+。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中Banksialactone A一致，此化合物被鑒定為Banksialactone A［13］。

化合物4：淡黃色固體，1H NMR顯示1個單態(tài)芳香族質(zhì)子（δH6.40），2個單態(tài)甲基（δH2.44， 1.74），1個乙烯基（δH5.10， 4.97），1個酚羥基（δH11.20），13C NMR光譜中，C-6共振出現(xiàn)在166.2 ‰處，表明在該位置有酚官能團(tuán)，C-9（δc 95.3）表明該位置有1 個烯烴，EI-MS： m/z 237.0773 ［M+Na］+。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中（R）-3，4-dihydro-4，6，8-trihydroxy-4，5-dimethyl-3-methyleneisochromen-1-one（1）一致，此化合物被鑒定為（R）-3，4-dihydro-4，6，8-trihydroxy-4，5-dimethyl-3-methyleneisochromen-1-one（1）［14］。

3 結(jié) 論

本研究以泰山白首烏根際土壤中篩選出一種富含次級代謝產(chǎn)物且具有良好活性的Leptosphaeriasp. CXY48菌株，采用薄層層析法、HPLC、減壓柱層析法和正/反相硅膠等手段，分離純化，并用質(zhì)譜、NMR等光譜技術(shù)對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定和活性評估；目前，共分離鑒定出4個單體化合物，其中2個具有抗菌作用。綜上，可推斷何首烏根際泥土中埋藏著豐富的真菌資源，是新型活性天然產(chǎn)物的重要泉源，為開發(fā)高效低毒的新型藥劑提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突