高 波

（瓦房店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 瓦房店 116300）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引發(fā)的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。口蹄疫是人畜共患傳染病，被國(guó)際獸醫(yī)組織確定為一類傳染病，主要侵害偶蹄獸，它的臨診特征為體溫升高、精神不振、流涎，在唇部?jī)?nèi)面、齒齦、舌面、蹄部、乳房處皮膚出現(xiàn)水皰，水皰逐漸破裂后，體溫達(dá)到正常?？谇粌?nèi)出現(xiàn)水皰期間，趾間、蹄冠的較軟皮膚也出現(xiàn)水皰，破裂的水皰短時(shí)間形成爛斑，隨后逐漸康復(fù)，若護(hù)理不當(dāng)，激發(fā)感染化膿菌，形成潰瘍壞死，甚至?xí)霈F(xiàn)蹄甲脫落。有的病牛在康復(fù)過(guò)程中，病情由好轉(zhuǎn)變?yōu)榧又兀硭ソ?，心臟停搏而死亡。此病傳染性極強(qiáng)。感染后傳播速度快，對(duì)人畜危害嚴(yán)重，因此，做好此疫病的預(yù)防、控制、消滅措施顯得格外重要。

口蹄疫病預(yù)防主要是通過(guò)疫苗的免疫使牛羊體內(nèi)產(chǎn)生抗體，來(lái)保護(hù)牛羊不再發(fā)病，免疫質(zhì)量好壞決定抗體的保護(hù)程度。通常采用酶聯(lián)免疫液相阻斷法檢測(cè)牛、羊血清中的口蹄疫O型抗體。檢測(cè)出抗體的OD值，通過(guò)OD值來(lái)判斷牛羊抗體的保護(hù)率。如果抗體的OD值下降，已經(jīng)不在保護(hù)范圍內(nèi)，就應(yīng)該立即進(jìn)行牛羊的疫苗免疫接種。不及時(shí)免疫，有可能造成牛羊發(fā)病，直接造成養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。

現(xiàn)接到檢測(cè)任務(wù)，需要將20份牛血清做O型口蹄疫抗體檢測(cè)，介紹如下。

1 檢驗(yàn)原理

采用酶聯(lián)免疫液相阻斷法。牛羊待檢樣品中O型抗體的含量與顯色OD值呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)與病毒抗原對(duì)比來(lái)判斷抗體效價(jià)。試劑盒在22℃的實(shí)驗(yàn)室回溫1小時(shí)。利用回溫時(shí)間準(zhǔn)備試驗(yàn)用的器材。100微升單道移液器、12道移液器、槍尖、量杯、量筒、加樣槽、拍板用的吸水紙等。

2 試劑配制

2.1 洗滌液配制

今天檢測(cè)牛血清樣品20份，洗板時(shí)所需要的洗滌液的體積為300微升×100孔×5次×2=300毫升。使用前拿出一包固體洗液加500毫升純化水，搖晃直至溶解，在無(wú)菌條件下配制試驗(yàn)用洗滌液，可以在2～8℃條件下保存7天。配制的洗滌液用于洗板和抗原的稀釋。

2.2 樣品稀釋液（1x）配制

20份樣品所需的樣品稀釋液（1x）的體積為12毫升。使用前，將濃縮樣品稀釋液（5x）1份加4份蒸餾水稀釋，即3毫升濃縮樣品稀釋液（5x）加入12毫升純化水。在無(wú)菌條件下配制（無(wú)菌水和無(wú)菌容器）樣品稀釋液（1x）共計(jì)15毫升。在2～8℃條件下能夠保存1個(gè)月。配制好的樣品稀釋液（1x）用來(lái)作樣品的稀釋，也用作陰陽(yáng)對(duì)照的稀釋。

3 具體操作步驟

試驗(yàn)前，將所有的試劑盒組份取出來(lái)，放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，應(yīng)恢復(fù)到20～26℃1小時(shí)。試劑使用時(shí)，輕輕搖晃均勻后倒入加樣槽內(nèi)。

稀釋濃縮病毒抗原：使用配制好的洗滌液，按450倍稀釋濃縮病毒抗原液（即1份濃縮病毒抗原加449份洗滌液），20微升的濃縮病毒抗原加入8.98毫升的洗滌液中，工作用的病毒抗原就配置好了。

血清稀釋板加樣操作步驟：試驗(yàn)以每板20份樣品操作，包被板A1～A10孔各加175微升的樣品稀釋液（1x)，A11、A12、孔各加100微升的樣品稀釋液（1x)。B1～B12、C1～C11、D1～D11、E1～E10孔各加175微升的樣品稀釋液（1x)，E11孔F1～F11、G1～G11、H1～H11孔各加100微升的樣品稀釋液（1x)。

包被板A1～A10孔分別加入待檢牛血清樣品S1～S10樣品25微升，E11～E20孔分別加入待檢牛血清樣品S11～S20樣品25微升，A11孔加100微升的陽(yáng)性對(duì)照，A12孔加100微升的陰性對(duì)照，用排槍吹打混勻（每孔吹打10次），待檢A11以100微升的量從A到H連續(xù)2倍稀釋，陰性對(duì)照A12以100微升/孔的量從A到B連續(xù)2倍稀釋。

待檢牛血清樣品A1～A10、E1～E10在第A1～10、E1～10列從1∶8稀釋至1∶1024，陽(yáng)性對(duì)照從1∶2稀釋至1∶256。由于試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照已1∶8稀釋，則變?yōu)閺?∶16稀釋至1∶2048，陰性對(duì)照從1∶2稀釋至1∶4。將以上稀釋好的溶液，用多道移液器從血清稀釋板上按照次序轉(zhuǎn)移至包被板上的對(duì)應(yīng)孔，50微升/孔，每個(gè)樣品使用1個(gè)單獨(dú)的槍頭。

加入按比例已經(jīng)稀釋好的病毒抗原，1～11列每孔各加入50微升，A12、B12每孔各加入50微升，E12、F12、G12、H12每孔各加入100微升，用振蕩器混勻，貼封板膜，放入已經(jīng)調(diào)試好的37℃恒溫箱溫育30分鐘。加樣完畢后，所有稀釋度翻倍，待檢樣品從1∶16～1∶2048，陽(yáng)性對(duì)照從1∶32～1∶4096，陰性對(duì)照從1∶4～1∶8。

從恒溫箱取出包被板，取出過(guò)程中要避免手指碰到包被板孔下底，避免影響OD值，把包被板內(nèi)每個(gè)孔里的液體甩出，然后用300微升的多道移液器調(diào)至280微升后，吸入已經(jīng)配好的洗滌液，洗滌包被板內(nèi)每孔，一共洗包被板5次。每次洗滌后都甩去孔內(nèi)的液體。在最后一次包被板洗滌液棄去后，把孔里留下的洗滌液在準(zhǔn)備好吸水紙上拍干。

將洗好的板里加入抗體溶液每孔50微升，再加入酶結(jié)合物每孔50微升，用振蕩器混勻，貼封板膜，放入已經(jīng)調(diào)試好的37℃恒溫箱溫育30分鐘。從恒溫箱取出包被板，如上面一樣洗板，然后把孔里留下的洗滌液在準(zhǔn)備好吸水紙上拍干。

試劑盒里的顯色液A取出6毫升，顯色液B取出6毫升，在避光環(huán)境里混勻后，每孔加入100微升，放入37℃恒溫箱避光溫育15分鐘。取出包被板，各個(gè)孔加入終止液50微升。放入酶標(biāo)儀，最后在（450納米）測(cè)量讀取OD值。

4 試驗(yàn)成立判斷

因?yàn)榕R界值等于0.937，病毒抗原對(duì)照OD值大于1.0，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照抗體效價(jià)在1∶1024±1之間，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照抗體效價(jià)小于1∶8，所以，本次試驗(yàn)成立。

5 最終結(jié)果判定

因?yàn)榭贵w效價(jià)≥1∶128，判為陽(yáng)性；抗體效價(jià)≤1∶64，判為陰性；抗體效價(jià)與牛攻毒保護(hù)關(guān)系為牛，抗體效價(jià)≥1∶128，99%以上保護(hù)；抗體效價(jià)≤1∶16，不保護(hù)；抗體效價(jià)在1∶22～1∶90，50%保護(hù)。樣品S1～S20，除S8外，其余樣品抗體效價(jià)均大于1∶128，為抗體陽(yáng)性，S8抗體效價(jià)小于1∶16，抗體陰性，所以，S8?？贵w不能夠起到保護(hù)作用，需要進(jìn)行O型口蹄疫疫苗免疫。

綜上，O型口蹄疫ELISA試驗(yàn)的抗體檢測(cè)，可以幫助養(yǎng)殖戶及時(shí)做好免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，避免免疫率下降后發(fā)病而造成的經(jīng)濟(jì)損失。因此，做好抗體檢測(cè)工作非常有必要。