胡冬春, 徐富強(qiáng), 劉 旭, 李樹忠, 馮從經(jīng)

(揚州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚州 225009)

在自然界中,昆蟲面對多種外源物侵染和環(huán)境脅迫。昆蟲被具有致病性和感染性的病原微生物侵染會引發(fā)免疫反應(yīng)。環(huán)境(如溫度、輻射、重金屬等)的刺激也會影響昆蟲的發(fā)育、免疫和行為等[1-3]。環(huán)境脅迫會導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)的生理代謝發(fā)生紊亂,而細(xì)胞作為生物體最基本的組成單位,在免疫、應(yīng)激和生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞因子是一種傳遞細(xì)胞間信號的蛋白質(zhì),幾乎影響著昆蟲所有的生理進(jìn)程[4-5]。由于作用形式不同,特定的細(xì)胞因子具有不同的功能,如參與免疫調(diào)控、抵抗炎癥、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、調(diào)節(jié)生長發(fā)育等[5]。

昆蟲生長阻滯肽(Growth-blocking peptide, GBP)首次被發(fā)現(xiàn)于寄生蜂(Cotesiakariyai)寄生后黏蟲(Pseudaletiaseparata)的血淋巴中,GBP導(dǎo)致被寄生幼蟲血淋巴中保幼激素酯酶(JHE)活性降低,延緩了幼蟲的生長發(fā)育[6]。近年來,GBP在不同種類昆蟲生長發(fā)育和免疫防御中的調(diào)控功能已被多次驗證[7-9]。

1 GBP及其同系物

GBP是昆蟲細(xì)胞因子的重要成員,作為免疫反應(yīng)的介質(zhì),促進(jìn)脅迫下的免疫應(yīng)答,也調(diào)控著昆蟲的生長發(fā)育。將細(xì)胞因子GBP注射至黏蟲的末齡幼蟲中,顯著干擾了幼蟲的正常發(fā)育[6,10]。隨后的研究結(jié)果進(jìn)一步證實GBP可參與體液免疫、誘導(dǎo)麻痹、血細(xì)胞擴(kuò)散、心率加速等生理過程。然而,目前僅在果蠅(Drosophilamelanogaster)體內(nèi)鑒定出DmGBP(果蠅生長阻滯肽)的唯一受體蛋白Mthl10,通過基因敲降確定了GBP-Mthl10在果蠅抵御環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[11]。此外,另一細(xì)胞因子應(yīng)激反應(yīng)肽(Stress-responsive peptide, SRP)被證明能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)GBP,通過RNAi和注射PsGBP(黏蟲生長阻滯肽),發(fā)現(xiàn)SRP可能是GBP下游的細(xì)胞因子,GBP轉(zhuǎn)錄水平的變化能夠調(diào)節(jié)黏蟲血淋巴中SRP的濃度,并通過減少覓食行為來誘導(dǎo)脅迫后的幼蟲生長遲緩[8]。

GBP最早在鱗翅目昆蟲中被發(fā)現(xiàn),但近年來研究結(jié)果表明在其他種類昆蟲中也存在GBP同源物,例如:鞘翅目、雙翅目、膜翅目及半翅目[12]。迄今,已在至少10種鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)了GBP的同源肽,它們具有不同的生物活性,如:誘導(dǎo)麻痹、細(xì)胞增殖、刺激漿細(xì)胞等[13-14]。 這些GBP同源肽含有23～25個氨基酸殘基,序列同源性約為70%～80%,基于它們共同的N端序列谷氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-(Glu-Asn-Phe-),這些肽被稱為ENF肽(圖1)[13-16]。N端的活性結(jié)構(gòu)部分對GBP蛋白的功能至關(guān)重要,Ishii等[17]合成了一種缺乏N端ENF殘基的截短形式的麻痹肽(Paralytic peptide, PP),證實其缺乏誘導(dǎo)家蠶麻痹和肌肉收縮的能力。Aizawa等[14]通過合成GBP的缺失和點突變體蛋白發(fā)現(xiàn)N端活性部分的特定殘基能夠影響GBP的生物活性,如:有絲分裂和漿血細(xì)胞擴(kuò)散活性。對PsGBP及BmPP(家蠶麻痹肽)蛋白的生長阻滯活性及核磁共振結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)其β-turn區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異造成2個肽不同的生物活性[18]。通過GBP及其同源肽的核磁共振波譜(NMR)分析推測這些細(xì)胞因子與哺乳動物的表皮生長因子(EGF)家族中的一個基序具有相似性[13]。目前,尚未在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)GBP的同源物,但有研究結(jié)果表明DmGBP與人類防御素BD2的序列、加工方式和通過IP/Ca2+級聯(lián)信號的作用方式存在一定的相似性[19-22]。

黑色部分表示8個序列完全相同的部分,方框部分表示保守部分,虛線為水解酶切割位點。MsGBP:黏蟲生長阻滯肽(GenBank 登錄號:AAB35742.1);HvGBP:綠棉鈴蟲生長阻滯肽(GenBank 登錄號:ACR78449.1);MbGBP:甘藍(lán)夜蛾生長阻滯肽(GenBank 登錄號:BAD20461.1);SeGBP:甜菜夜蛾生長阻滯肽(GenBank 登錄號:AGO02159.1);OfGBP:亞洲玉米螟生長阻滯肽(GenBank 登錄號:QWX20072.1);HaGBP:棉鈴蟲生長阻滯肽(GenBank 登錄號:AUB45120.1);SePP:甜菜夜蛾麻痹肽(GenBank 登錄號:AEK12768.1);PmPSP:燕鳳尾蝶漿細(xì)胞延展肽(GenBank 登錄號:KPJ16907.1)。圖1 昆蟲生長阻滯肽(GBP)家族成員與其他ENF肽的氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment between growth-blocking peptide (GBP) family members and other ENF peptides

2 GBP影響昆蟲的生長發(fā)育

GBP對昆蟲生長的調(diào)控與激素相關(guān)。GBP通過抑制JHE活性來延緩昆蟲生長,但其抑制昆蟲血淋巴中JHE活性的機(jī)制尚不清楚[6,23]。Noguchi等[24-25]發(fā)現(xiàn)在黏蟲幼蟲體內(nèi)PsGBP能夠顯著調(diào)節(jié)多巴胺的水平。多巴胺在昆蟲的生長周期中能夠調(diào)控激素的合成,從而影響昆蟲的發(fā)育過程[26-28],因此推測PsGBP可通過調(diào)節(jié)多巴胺的表達(dá)水平來影響昆蟲的生長。為了進(jìn)一步研究GBP的功能,以果蠅作為模式生物進(jìn)行GBP調(diào)節(jié)生長機(jī)制的研究。Tsuzuki等[7]克隆并鑒定得到黑腹果蠅(D.melanogaster)的GBP同系物DmGBP1(CG15917),該基因編碼含有118個氨基酸的蛋白質(zhì),與鱗翅目昆蟲GBP的一級結(jié)構(gòu)相似。對DmGBP1進(jìn)行RNAi敲降以及過表達(dá)試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DmGBP由脂肪體合成,分泌至血淋巴中,作用于雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號傳導(dǎo)途徑的下游分子,刺激細(xì)胞產(chǎn)生和分泌胰島素樣肽(Insulin-like peptides, ILP),并增加大腦中胰島素樣肽生長因子的信號活性,促進(jìn)營養(yǎng)生長[29],由此可推測GBP通過干預(yù)胰島素通路來調(diào)節(jié)生長代謝。Meschi等[30]也發(fā)現(xiàn)GBP與胰島素通路及營養(yǎng)生長有密切關(guān)系,GBP是表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的一種非典型配體,由脂肪體合成的GBP激活EGFR后,作用于胰島素合成細(xì)胞(Insulin-producing cells, IPC)和連接神經(jīng)元(IPC-connecting neurons, ICN),可減輕ICN介導(dǎo)的IPC功能抑制,從而間接促進(jìn)IPC分泌ILP,促進(jìn)營養(yǎng)生長。DmGBP由脂肪體產(chǎn)生,通過血淋巴長距離轉(zhuǎn)移至大腦,但尚不清楚其作用于ICN的分子機(jī)制與途徑。

有研究結(jié)果表明,DmGBP在胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。在果蠅胚胎發(fā)育早期,DmGBP將雙側(cè)葉融合在一起,促進(jìn)了其前腦結(jié)構(gòu)的形成[31]。已知Dfd轉(zhuǎn)錄表達(dá)能夠促進(jìn)幼蟲頭部上頜形態(tài)形成[32],而在黏蟲中利用RNAi敲降Dfd表達(dá)的研究結(jié)果顯示Dfd能夠間接或直接調(diào)控DmGBP的表達(dá)水平,這些結(jié)果間接表明GBP可能參與昆蟲的胚胎發(fā)育[31,33]。

在其他昆蟲的發(fā)育過程中,GBP也扮演著十分重要的角色。蛻皮和變態(tài)是全變態(tài)昆蟲的典型發(fā)育特征。如鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)完成其生活史需要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段,由保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)調(diào)控其發(fā)育歷程。已有研究結(jié)果證明,用從桿狀病毒侵染的昆蟲細(xì)胞中純化得到的SeGBP(甜菜夜蛾生長阻滯肽)注射甜菜夜蛾幼蟲,可導(dǎo)致其生長延緩、化蛹時間延長且蟲體質(zhì)量顯著降低;同時,蛻皮甾酮可上調(diào)SeGBP的表達(dá),而保幼激素類似物下調(diào)SeGBP的表達(dá),說明SeGBP在保幼激素和蛻皮甾酮的調(diào)控下作為一種生長因子調(diào)控甜菜夜蛾的發(fā)育進(jìn)程[34]。此外,Duressa等[16]利用質(zhì)譜法及生物測定法,分離鑒定了蝗蟲(Locustamigratoria)體內(nèi)GBP的同系物,在注射10～100 pmol的蝗蟲GBP后,40%～50%的成蟲延遲了蛻皮。

在昆蟲體內(nèi)GBP的表達(dá)量時刻動態(tài)地變化著。適量的GBP表達(dá)水平會促進(jìn)昆蟲免疫應(yīng)答和生長發(fā)育,但過量的GBP則導(dǎo)致幼蟲形態(tài)異常,甚至死亡[35]。有研究結(jié)果表明,高濃度的GBP能夠顯著降低黏蟲幼蟲的生長速度[36],并且以濃度依賴的方式導(dǎo)致家蠶(Bombyxmori)四齡幼蟲麻痹和死亡[18]。同時,將BmGBP(家蠶生長阻滯肽)注射至饑餓處理的四齡家蠶幼蟲中,會導(dǎo)致其前腸極度腫脹,而未經(jīng)饑餓處理的幼蟲也出現(xiàn)同樣的表征,并且引起前腸區(qū)域內(nèi)食物堆積,這可能是由于高濃度的BmGBP紊亂了腸道的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能所致[35],BmGBP可能通過影響腸道生理功能來延緩幼蟲生長。

3 GBP影響昆蟲免疫

在復(fù)雜生境下,昆蟲依賴天然免疫系統(tǒng)防御病原微生物的侵染并維持機(jī)體免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)。昆蟲天然免疫主要由細(xì)胞免疫及體液免疫組成,抗菌肽是昆蟲體液免疫的主要效應(yīng)分子[37-38]。果蠅在感染黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)及受到溫度脅迫、機(jī)械損傷脅迫后,脂肪體中的DmGBP基因以及抗菌肽編碼基因被顯著上調(diào)表達(dá);單獨RNAi干擾DmGBP導(dǎo)致抗菌肽表達(dá)量降低,而利用hs-Gal4/UAS-GBP體系過表達(dá)DmGBP會導(dǎo)致抗菌肽的表達(dá)量上升。上述研究結(jié)果證明外來細(xì)菌入侵和環(huán)境的物理脅迫都會導(dǎo)致DmGBP表達(dá)量上升,從而促進(jìn)應(yīng)激源誘導(dǎo)的抗菌肽表達(dá)[7]。另外,GBP同系物已經(jīng)被證明在果蠅中發(fā)揮細(xì)胞因子的作用,能夠促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生并誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達(dá),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而防御外來病原物的侵染[17]。

在細(xì)胞試驗中,從黑腹果蠅體內(nèi)分離得到的DmGBP會促進(jìn)血細(xì)胞擴(kuò)散,這與在蝗蟲體內(nèi)注射GBP而導(dǎo)致血細(xì)胞擴(kuò)散性增加的結(jié)果一致[7,16]。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,DmGBP還在昆蟲體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫的作用。DmGBP通過磷脂酶C/Ca2+信號級聯(lián)作用,介導(dǎo)血小板衍生生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體同源物的分泌,從而級聯(lián)放大細(xì)胞外信號,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)激酶來抑制抗菌肽的合成,即抑制體液免疫,促進(jìn)血細(xì)胞擴(kuò)散,調(diào)控細(xì)胞免疫[39]。使用蛋白質(zhì)免疫印記和免疫熒光染色并結(jié)合分子生物學(xué)試驗發(fā)現(xiàn),SeGBP可與球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的細(xì)胞壁結(jié)合,且在抗菌活性測定中發(fā)現(xiàn)SeGBP能夠殺死球孢白僵菌,表明GBP及其同系物可能在昆蟲體內(nèi)具有類似抗菌肽的功能以抵御細(xì)菌入侵[34]。

4 GBP對昆蟲其他生理活動的調(diào)控

通過靶向篩選編碼膜蛋白基因的dsRNA文庫,Sung等[11]鑒定到G蛋白偶聯(lián)受體Mthl10是DmGBP的膜受體。通過敲降Mthl10,顯著降低了果蠅對外界脅迫(如低溫、細(xì)菌感染等)的防御和抵抗能力。但DmGBP與其受體Mthl10的結(jié)合不僅可以抵御外界脅迫,對于自身機(jī)體損傷的修復(fù)也同樣發(fā)揮重要作用。有研究結(jié)果表明,DmGBP會參與細(xì)胞對傷口的修復(fù),GBP作為Mthl10的配體,與Mthl10結(jié)合后激活下游Ca2+的釋放,進(jìn)一步促進(jìn)傷口修復(fù)和免疫反應(yīng)[40]。DmGBP誘導(dǎo)的Ca2+濃度增加還會導(dǎo)致多巴脫羧酶和酪氨酸羥化酶的特異性表達(dá),從而影響?zhàn)はx幼蟲表皮黑色素和多巴胺的合成[9,41]。

桿狀病毒是一類大分子的雙鏈DNA病毒,僅感染節(jié)肢動物,尤其是鱗翅目昆蟲,而對非靶標(biāo)生物無害[42]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),將SeGBP的cDNA序列和蜜蜂蜂毒信號肽融合,插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體 pBacPAK8中,成功在桿狀病毒AcNPV中表達(dá)SeGBP,侵染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf9)后導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低。免疫熒光染色定位SeGBP位于Sf9的細(xì)胞質(zhì)中,與野生型AcNPV侵染Sf9相比,重組 AcNPV顯著誘導(dǎo)了Sf9細(xì)胞凋亡[43]。

5 GBPs參與的信號通路

在果蠅這一模式動物中,GBP信號通路研究得較為清楚。當(dāng)果蠅受到外源刺激時,可通過血淋巴中的活性氧刺激血細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度上升,釋放出一種未知的、相對分子質(zhì)量大小約為50 000的激活因子來激活DmGBP水解蛋白,從而將脂肪體中ProGBP的N-端活性肽部分水解而激活,激活后的DmGBP與其受體結(jié)合,通過免疫缺陷(IMD)通路中的轉(zhuǎn)化生長因子激酶下游分支,激活c-Jun氨基末端激酶信號通路,促進(jìn)抗菌肽的表達(dá),并通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)。當(dāng)果蠅在正常的環(huán)境下生長時,雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin,TOR)能夠感知營養(yǎng)狀態(tài),使適量的DmGBP通過血淋巴長距離轉(zhuǎn)移至大腦,促進(jìn)胰島素的分泌,從而促進(jìn)生長(圖2)[11,29,39-40,44-45]。

GBP:生長阻滯肽;PLC:磷脂酶C;Pvf:血小板衍生生長因子;Pvr:血管內(nèi)皮生長因子受體; JNK:c-Jun氨基末端激酶;IMD:免疫缺陷;Mthl 10:GBP受體;FoxO:叉頭盒蛋白O。圖2 生長阻滯肽(GBP)參與昆蟲生理調(diào)控的工作模型Fig.2 Working model of growth-blocking peptide (GBP) participating in insect physiological regulation

GBP在血淋巴中的濃度由GBP結(jié)合蛋白(GBP-binding protein,GBP-BP)調(diào)控。Matsumoto等[46]發(fā)現(xiàn)PsGBP激活細(xì)胞免疫反應(yīng)后,類絳色細(xì)胞在PsGBP刺激下裂解釋放PsGBP-BP,該蛋白質(zhì)能夠顯著降低血淋巴中PsGBP的濃度。后續(xù)的試驗結(jié)果證明這一調(diào)節(jié)反應(yīng)可能是由昆蟲蛻皮激素調(diào)控,Zhuo等[47]使用20羥基蛻皮酮(20E)處理棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)后,由類絳色細(xì)胞釋放的HaGBP-BP通過其N端結(jié)合并清除血漿中的HaGBP,從而抑制了HaGBP誘導(dǎo)的漿血細(xì)胞擴(kuò)散和包囊作用,有利于昆蟲迅速實現(xiàn)從細(xì)胞免疫到體液免疫的轉(zhuǎn)變。這一負(fù)反饋調(diào)節(jié)似乎再次驗證了GBP在平衡昆蟲細(xì)胞免疫和體液免疫中起到至關(guān)重要的作用。

6 展 望

關(guān)于GBP的功能和調(diào)控機(jī)制尚有諸多未解之謎。GBP是一種雙重生長調(diào)節(jié)因子,在高濃度時抑制幼蟲生長,在低濃度時促進(jìn)細(xì)胞增殖[36]。通過敲除與過表達(dá)試驗,Koyama等[29]驗證了GBP在果蠅體內(nèi)產(chǎn)生作用具有劑量依賴性,證明適度表達(dá)量下的GBP可能對昆蟲的生長有積極作用。但在昆蟲體內(nèi),是何物質(zhì)調(diào)控GBP及通過什么途徑維持GBP的平衡仍需要更進(jìn)一步的研究。

哺乳動物中,脂肪組織與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息交流在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。在發(fā)生慢性炎癥時,往往會產(chǎn)生錯誤的能量存儲和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。最新的研究結(jié)果揭示了神經(jīng)元介導(dǎo)的哺乳動物大腦與脂肪組織間的連接與通信是保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[48]。而在昆蟲體內(nèi),激活免疫反應(yīng)需要龐大的能量供應(yīng),因此需要減少非免疫組織代謝的信號傳導(dǎo)與能量分配[49]。目前,已有研究結(jié)果表明昆蟲免疫反應(yīng)和生長代謝之間平衡的相關(guān)分子機(jī)制。果蠅在進(jìn)行免疫應(yīng)激反應(yīng)時,體內(nèi)的Toll信號途徑會抑制胰島素信號,從而降低營養(yǎng)存儲和生長代謝,以增強(qiáng)對外源脅迫的抵抗性和適應(yīng)性[50]。由脂肪體產(chǎn)生的細(xì)胞因子GBP能夠激活免疫反應(yīng),也可傳遞至大腦中促進(jìn)胰島素的合成,從而促進(jìn)生長。研究GBP權(quán)衡這2種存在能量分配的生理過程的分子機(jī)制,分析機(jī)體如何調(diào)控GBP進(jìn)行組織間的轉(zhuǎn)運與分布,或許會為揭示昆蟲體內(nèi)“脂肪體-大腦”的組織間通信交流、生物適應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)制提供新思路。

GBP與寄生體系密切相關(guān)[6]。被內(nèi)寄生蜂(C.kariyai)寄生后的黏蟲(P.separata)神經(jīng)節(jié)中GBP的表達(dá)量比未寄生幼蟲高2～3倍[51]。有研究結(jié)果表明,在寄生或注射多分DNA病毒(Polydnavirus, PDV)后,黏蟲幼蟲脂肪體中的ProGBP與GBP加工酶的活性水平顯著提高[36]。寄生蜂通過寄生因子調(diào)控寄主昆蟲免疫與發(fā)育已被多次驗證[52]。在功能上,GBP參與的生理調(diào)節(jié)反應(yīng)與寄生因子相近,主要包括抑制或延緩寄主昆蟲發(fā)育,調(diào)節(jié)其免疫反應(yīng)等。推測GBP可能被寄生蜂的寄生因子調(diào)控,從而改變寄主昆蟲體內(nèi)的免疫與代謝水平,為寄生蜂子代創(chuàng)造最佳生長發(fā)育環(huán)境。深入研究GBP與寄生物及宿主昆蟲之間的聯(lián)系,并結(jié)合“以蟲治蟲”的方法,可有助于開發(fā)出針對害蟲防治的植保新技術(shù)。