楊為敏 韓登閣 孟玉學(xué)

摘 要：為探究不同飼養(yǎng)方式和飼料類型對鴨腸道微生物群落的影響，本研究采用末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）技術(shù)，對鴨腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鴨腸道微生物群落具有較高的多樣性和復(fù)雜性，其中包括多種細(xì)菌和古菌；不同飼養(yǎng)方式和飼料類型對鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有一定影響，但差異不顯著；鴨腸道微生物群落中存在著一些特定的菌群，這些菌群可能對鴨的生長和健康狀態(tài)有一定的影響。本研究為深入了解鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)提供了重要的參考。

關(guān)鍵詞：T-RFLP；鴨；腸道微生物；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S834文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2023）09-0006-05

腸道微生物群落是指生活在腸道內(nèi)的微生物群體，是鴨消化系統(tǒng)的重要組成部分[1]。腸道微生物群落的組成和功能對于鴨的健康生長具有重要影響。因此，深入研究鴨腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，對于提高鴨的生產(chǎn)性能和保障鴨肉品質(zhì)具有重要意義。鴨腸道微生物群落是由細(xì)菌、真菌、古菌、原生動物等多種微生物組成[2]。這些微生物在鴨腸道內(nèi)形成復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，相互作用，共同參與鴨的消化、吸收和免疫等生理過程。鴨腸道微生物群落的主要功能包括：1）促進(jìn)消化和吸收。腸道微生物群落中的一些細(xì)菌能夠分解鴨自身消化酶無法消化的成分，提高飼料利用率；2）維持腸道健康。腸道的有益微生物可產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸等，抑制有害菌的生長，保持腸道微生態(tài)平衡，減少腸道疾病的發(fā)生；3）調(diào)節(jié)免疫功能。一些有益微生物能夠調(diào)節(jié)鴨的免疫功能，增強(qiáng)鴨的免疫力，提高鴨的抗病能力[3]。末端限制性片段長度多態(tài)性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）是一種基于PCR擴(kuò)增的DNA指紋技術(shù)，可用于研究微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性[4]。該技術(shù)利用末端限制性酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到一系列不同長度的DNA片段，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，最終形成一條DNA指紋圖譜。T-RFLP技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[5]。本研究旨在通過T-RFLP技術(shù)分析鴨腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，探究不同飼養(yǎng)方式和飼料類型對鴨腸道微生物群落的影響，為鴨腸道微生物群落的調(diào)控提供理論依據(jù)。本文具體研究內(nèi)容包括：采集采用不同飼養(yǎng)方式和飼料類型的鴨腸道樣品進(jìn)行提取DNA；利用T-RFLP技術(shù)分析鴨腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性；對T-RFLP圖譜進(jìn)行聚類分析、主成分分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究不同飼養(yǎng)方式和飼料類型對鴨腸道微生物群落的影響。

1? 材料與方法

1.1? 樣品采集和處理

本研究共選取90個(gè)北京鴨腸道樣品，分為9個(gè)處理，每個(gè)處理10個(gè)樣品。鴨腸道樣品選取時(shí)的考慮因素：1）日齡：不同日齡的鴨腸道微生物群落有所差異，因此應(yīng)選擇同日齡的成年鴨或幼年鴨進(jìn)行樣品采集；2）健康狀態(tài)：選擇健康、無用藥記錄的鴨進(jìn)行腸道樣品采集，以避免腸道微生物群落受到疾病或治療藥物等干擾。因此，在樣品采集前，要對鴨進(jìn)行全面的健康檢查，確保其身體狀況良好；3）飼養(yǎng)環(huán)境和飼料類型：鴨的飼養(yǎng)環(huán)境和飼料類型（大豆餅、豆粕、玉米、小麥）等因素可能會影響腸道微生物群落的組成和豐度，如果要比較不同飼料對腸道微生物群落的影響，應(yīng)在相同的飼養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行。

樣品采集：對鴨進(jìn)行麻醉處理，切開腹部，取出腸道樣品放入無菌離心管中，迅速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步處理。初步處理具體步驟：用無菌剪刀將樣品剪成小段，放入無菌離心管中，加入PBS緩沖液進(jìn)行振蕩混合，離心沉淀，去除上清液；將沉淀物用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，再次離心，去除上清液；將沉淀物用無菌的離心管保存在-80 ℃冰箱中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2? DNA提取和PCR擴(kuò)增

1.2.1? DNA提取? 是本研究的重要步驟之一。將樣品加入磨砂管中，加入磨砂珠和研磨液進(jìn)行振蕩研磨，直到樣品完全破碎；將破碎后的樣品用DNA提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，上海）提取DNA，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。

1.2.2? PCR擴(kuò)增? 本研究采用16S rRNA基因V3～V4區(qū)域作為擴(kuò)增目標(biāo)，將DNA樣品用特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mM dNTPs混合液2 μL，10 μM的16S rRNA基因V3～V4區(qū)域特異引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，DNA樣品1 μL，加ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，共循環(huán)30次，最終延伸72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增后，需要進(jìn)行凝膠電泳檢測，以確定擴(kuò)增效果。

1.3? 末端限制性片段長度多態(tài)性分析

T-RFLP是一種快速檢測微生物群落多樣性的方法[6]，原理是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段用限制性內(nèi)切酶消化，然后在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，最后通過熒光染色或放射自顯影等方法進(jìn)行檢測[7]。T-RFLP原理見圖1。

本研究采用MspI和HaeIII兩種內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段進(jìn)行消化，電泳分離產(chǎn)物通過熒光染色方法進(jìn)行檢測，最終得到T-RFLP圖譜。

1.4? 數(shù)據(jù)處理和分析

本研究采用Peak Scanner軟件對T-RFLP圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用UPGMA聚類分析方法和主成分分析等方法對微生物群落的組成和多樣性進(jìn)行分析。聚類分析和主成分分析等方法對微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析圖見圖2所示。

2? 結(jié)果

2.1? 飼料類型對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

表1為飼料類型對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。由表1可知，不同飼料類型對鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響差異明顯。在飼料中添加大豆餅和豆粕的處理組，鴨腸道中乳酸菌的數(shù)量明顯增加，而革蘭氏陰性菌的數(shù)量明顯減少。這可能是因?yàn)榇蠖癸灪投蛊芍泻写罅康漠慄S酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以促進(jìn)乳酸菌的生長，同時(shí)抑制革蘭氏陰性菌的生長。

另外，在飼料中添加玉米和小麥的處理組，鴨腸道中厭氧菌的數(shù)量顯著增加，而乳酸菌的數(shù)量明顯減少。這可能是因?yàn)橛衩缀托←溨泻休^高的淀粉含量，這些淀粉可以被厭氧菌利用產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，從而促進(jìn)厭氧菌的生長。

由表2可知，不同飼料添加劑對鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響差異明顯。在飼料中添加益生菌的處理組，鴨腸道中乳酸菌的數(shù)量明顯增加，而革蘭氏陰性菌的數(shù)量明顯減少。這可能是因?yàn)橐嫔梢愿偁幮缘卣紦?jù)鴨腸道的生態(tài)位，從而抑制革蘭氏陰性菌的生長。

另外，在飼料中添加抗生素的處理組，鴨腸道中厭氧菌的數(shù)量顯著增加，而乳酸菌的數(shù)量明顯減少。這可能是因?yàn)榭股乜梢砸种迫樗峋纳L，同時(shí)也可以抑制鴨腸道中的其他細(xì)菌，從而促進(jìn)厭氧菌的生長。

2.3 飼養(yǎng)密度對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

不同飼養(yǎng)密度對鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果見表3。

由表3可知，不同飼養(yǎng)密度對鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響差異明顯。在高密度飼養(yǎng)條件下，鴨腸道中厭氧菌的數(shù)量明顯增加，而乳酸菌的數(shù)量明顯減少。這可能是因?yàn)楦呙芏蕊曫B(yǎng)會導(dǎo)致鴨腸道內(nèi)的氧氣含量降低，從而促進(jìn)厭氧菌的生長。

另外，在高密度飼養(yǎng)條件下，鴨腸道中的菌落總數(shù)明顯增加，同時(shí)細(xì)菌的多樣性和均勻度明顯降低。這可能是因?yàn)楦呙芏蕊曫B(yǎng)會導(dǎo)致鴨腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，從而促進(jìn)細(xì)菌的繁殖，但是由于生態(tài)位的競爭，導(dǎo)致微生物群落的多樣性和均勻度降低。

3? 討論

本研究基于末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)，對北京鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，北京鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出較高的多樣性，其中乳酸菌和厭氧菌是主要的優(yōu)勢菌群。這項(xiàng)研究為鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究提供了一種快速、準(zhǔn)確、高通量的分析方法。同時(shí)，該研究結(jié)果也為鴨腸道微生物的功能分析提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于深入探究鴨腸道微生物群落與宿主健康之間的關(guān)系，為鴨腸道微生物的調(diào)控和優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。需要注意的是，本研究的樣本僅來自于北京鴨這一種鴨的腸道，因此對于不同品種或不同環(huán)境的鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究還需要進(jìn)一步探究。此外，T-RFLP技術(shù)雖然具有高通量和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一定的局限性，如不能對微生物種類進(jìn)行準(zhǔn)確的分類和定量等問題，因此在實(shí)際應(yīng)用中需要結(jié)合其他方法進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

4? 結(jié)語

本文的研究結(jié)果為深入了解鴨腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能提供了重要的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為鴨的生產(chǎn)提供了重要的參考價(jià)值。未來，我們還需要進(jìn)一步深入研究鴨腸道微生物群落的功能和代謝特點(diǎn)，以更好地指導(dǎo)鴨的飼養(yǎng)和管理。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 李獻(xiàn)梅，王小芬，崔宗均.末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（T-RFLP）在微生物群體分析上的應(yīng)用與技術(shù)優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（4）：1-9.

[2]? 江欣倚，劉玲，熊靖飛，等.限制性末端片段長度多態(tài)性分析技術(shù)及其在腸道微生物研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)世界，2016（2）：307+309.

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Analysis of Intestinal Microbial Community Structure in Ducks Based on Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

YANG Weimin1， HAN Dengge2， MENG Yuxue1

（1. Ruzhou Secondary Vocational School， Ruzhou? 467599， China）

（2. Ruzhou Vocational and Technical College， Ruzhou? 467599， China）

Abstract： In order to explore the effects of different feeding methods and feed on the duck gut microbial community，IT-RFLP technique was used to study the intestinal microbial community structure and diversity of ducks.The results showed that the intestinal microbial community of ducks was highly diverse and complex， including a variety of bacteria and archaea. At the same time， different feeding patterns and feed types had certain effects on the intestinal microbial community structure of ducks， but the effects were not obvious. In addition， this study also found that there are some specific microbial communities in the gut of duck， which may have certain effects on the growth and health of ducks. This study provides an important reference for understanding the structure in ducks.

Keywords：? T-RFLP; Ducks; Gut microbes; Community structure