陳能安

（廣西容縣石頭鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西容縣 537519）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種急性腸道傳染病[1-3]，該病發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)，各個(gè)年齡段的豬都可以感染，仔豬感染后死亡率較高，本病一年四季都可以發(fā)生，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是2010 年以來PEDV出現(xiàn)變異毒株，進(jìn)一步增加了PEDV 對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的威脅，也增加了PEDV 的防控難度[4,5]。為了加強(qiáng)PEDV 的臨床診斷，本研究根據(jù)GenBank 上的PEDV 保守區(qū)N基因序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，建立了PEDV 一步RT-PCR 診斷方法，該方法對(duì)經(jīng)典毒株及變異毒株都可以檢出，將為PEDV 的早期診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 毒株

PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（PRRSV）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與試劑盒

BamHI 和XholI 限制性內(nèi)切酶、pMD18-T 載體、一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒均為TaKaRa 公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒為AXYGEN 公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[6]，根據(jù)GenBank 中登錄的PEDV 經(jīng)典株和變異株保守區(qū)N 基因組序列，用Oligo 6.0 生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性檢測(cè)引物，上游引物F：5’-CAACAGAGGCAATAAC-3’；下游引物 R：5’-CGCTAGCTCACGAAC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為541 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA/RNA 的提取

按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒的使用說明書，依次提取PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA。

1.5 一步RT-PCR 擴(kuò)增與測(cè)序鑒定

將提取的PEDV 經(jīng)典株和變異株基因組RNA，參照一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×Buffer 12.5 μL、酶0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 3 μL、H2O 8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃30 min；95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。一步法RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀測(cè)擴(kuò)增片段大小。將擴(kuò)增片段用膠回收試劑盒回收純化后連接至pMD18-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落增菌培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用BamHI 和XholI 雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別對(duì)PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

根據(jù)辛忠昊[7]、丁光明[8]的研究基礎(chǔ)，將提取的PEDV 經(jīng)典株和變異株基因組RNA 等量混合，測(cè)定混合基因組RNA 濃度，將混合基因組RNA 依次進(jìn)行10 倍倍比稀釋，依次對(duì)各稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

參考張夢(mèng)巖[9]的研究，分別對(duì)PEDV 經(jīng)典株、PEDV變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 及3 份PEDV 陽(yáng)性樣品和3 份PEDV 陰性樣品進(jìn)行3 次重復(fù)檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.9 臨床應(yīng)用

利用建立的RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)廣西容縣及周邊地區(qū)送檢的264 份臨床腹瀉腸道組織樣品或新鮮糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，掌握廣西容縣及周邊地區(qū)PEDV 的感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步RT-PCR 擴(kuò)增與測(cè)序鑒定結(jié)果

RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，PEDV 經(jīng)典株和變異株均可見541 bp 的特異性片段。將擴(kuò)增片段用膠回收試劑盒回收純化后連接至pMD18-T 載體，雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定分別為PEDV 經(jīng)典株和變異株特異性序列。

圖1 PEDV 經(jīng)典株和變異株的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后結(jié)果如圖2 所示，PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株均可擴(kuò)增出541 bp 的特異性片段，而TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因組DNA/RNA 經(jīng)一步RT-PCR 檢測(cè)后擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明該檢測(cè)方法有很好的特異性。

圖2 PEDV 經(jīng)典株、PEDV 變異株、TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

PEDV 經(jīng)典株和變異株混合基因組RNA 濃度為1.56 mg/mL，混合基因組RNA 依次進(jìn)行10 倍倍比稀釋后經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示，混合基因組RNA 在10-4倍稀釋后擴(kuò)增結(jié)果依然為陽(yáng)性，由于RT-PCR 擴(kuò)增體系中RNA 的用量為3 μL，說明該檢測(cè)方法對(duì)PEDV的最低檢測(cè)下線為0.47 ng RNA，該檢測(cè)方法有很好的敏感性。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)與臨床應(yīng)用結(jié)果

3 次重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果均完全一致，說明該檢測(cè)方法有很好的重復(fù)性。264 份臨床腹瀉樣品中共檢出陽(yáng)性樣品56 份，陽(yáng)性率為21.21%，廣西容縣地區(qū)豬場(chǎng)中，豬的臨床腹瀉病例中普遍存在PEDV 的流行。

3 討論

引起豬病毒性腹瀉的病原很多，包括PEDV、TGEV、PCV-2、PRV 等，其中以PEDV 的感染最常見[10,11]，PEDV 的準(zhǔn)確診斷是有效防控豬病毒性腹瀉疫病的關(guān)鍵。當(dāng)前針對(duì)PEDV 的病原學(xué)診斷方法應(yīng)用較多的是RT-PCR 方法和熒光RT-PCR 方法，熒光RT-PCR 方法存在檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，而RT-PCR 方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，比較適合于基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[12]。鑒于此，本研究在常規(guī)RT-PCR 方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用一步法RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，使RNA 的反轉(zhuǎn)錄過程和PCR 過程一步完成，操作更加簡(jiǎn)單、檢測(cè)更加快速。試驗(yàn)結(jié)果表明建立的一步法RT-PCR 診斷方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和適用性，可以用于臨床樣品快速檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。

當(dāng)前PEDV 流行廣泛，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害很大，周宇駿等[13]2021 年從湖南省不同地區(qū)213 個(gè)豬場(chǎng)采集疑似感染PEDV 樣品共1 406 份，采用熒光RT-PCR 方法對(duì)采集樣品進(jìn)行PEDV 病原檢測(cè)，平均陽(yáng)性檢出率為21.55%。陳勝男等[14]將2021 年采集的來自廣東省主要地市養(yǎng)豬場(chǎng)的379 份樣品進(jìn)行PEDV 病原檢測(cè)，PEDV陽(yáng)性率為13.19%。王妍等[15]于2021 年3 月至2022 年2 月，從湖北地區(qū)共收集臨床具有腹瀉癥狀的糞便—肛門棉拭子1 580 份，采用PCR 法進(jìn)行PEDV 病原檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為20.13%。本研究采用RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)廣西容縣及周邊地區(qū)送檢的264 份臨床腹瀉樣品進(jìn)行PEDV 病原檢測(cè)，平均陽(yáng)性率為21.21%，本研究檢測(cè)結(jié)果與周宇駿等[13]、陳勝男等[14]、王妍等[15]的檢測(cè)結(jié)果基本持平，表明廣西容縣存在PEDV 的流行，且流行陽(yáng)性率與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)基本一致，廣西容縣應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PEDV感染情況的重視，加強(qiáng)對(duì)PEDV 的監(jiān)測(cè)，逐步完善和提高PEDV 的綜合防控措施。

4 小結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)，PEDV 經(jīng)典株和變異株均可擴(kuò)增出541 bp 特異性片段，而檢測(cè)TGEV、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV 的基因片段均為陰性，說明廣西容縣地區(qū)的豬場(chǎng)主要流行PEDV。通過靈敏檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)PEDV 的最低檢測(cè)下限為0.47 ng RNA。