劉志宏 田 媛 陳紅娜 周志豪 鄭 潔 楊曉懷

（1 深圳市農業(yè)科技促進中心，廣東 深圳 518000；2 暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

水稻（Oryza sativaL.）作為世界上重要的糧食作物之一，為世界超過1/3 的人口提供了主糧，全球種植面積約1.4 億hm2[1]?！笆濉币詠?，我國水稻產量連續(xù)穩(wěn)定在2 億t 以上[2]。水稻作為我國的主要糧食作物，在我國糧食生產領域占據著十分重要的地位，水稻品種改良仍是保障種業(yè)持續(xù)發(fā)展和國家糧食安全的重點。黨的十八大以來，習近平總書記高度關心我國種業(yè)安全與發(fā)展，強調要把民族種業(yè)搞上去[3]。如今，隨著生物技術發(fā)展的不斷深入，我國水稻種業(yè)迎來了全新的挑戰(zhàn)和機遇。轉基因技術相較于傳統水稻育種技術，屬于新興生物育種技術，為水稻育種提供了新思路。轉基因技術近年來發(fā)展迅速，國內外已成功商業(yè)化應用于多種農作物，如甜菜、大豆、玉米和棉花等[4]。本文重點概述轉基因技術在水稻抗病蟲相關育種領域的國內外研究進展和應用情況，同時探究轉基因技術在我國水稻育種領域的發(fā)展前景。

1 轉基因技術

1.1 國內外轉基因作物發(fā)展現狀轉基因技術作為現代農業(yè)生物技術的核心組成部分，利用基因重組原理將一種生物的優(yōu)良基因整合到另一種生物基因組中，使目標生物的基因得到優(yōu)化并能進行表達和遺傳，同時使目標生物獲得優(yōu)良性狀，如抗蟲性、抗逆性等[5]。

自1996 年首例轉基因農作物商業(yè)化應用以來，發(fā)達國家紛紛把轉基因技術作為國家戰(zhàn)略重點以增強農業(yè)國際競爭力。截至2021 年，全球轉基因作物產量已達1.9 億hm2[6]，如表1 所示，各國之間的轉基因作物種植情況差異較大。中美之間對于轉基因作物研發(fā)應用及法規(guī)管理均有許多不同，美國在立法上對于轉基因作物較為寬松，沒有單獨的轉基因作物管理體制，在管理上禁止對轉基因食品及種子進行強制標注。

表1 2019-2021 年主要國家轉基因作物及種植面積[6]

表1 數據顯示，我國轉基因作物的種植面積較少，究其原因，主要是我國對轉基因作物的相關管理十分嚴格，專門設有農業(yè)轉基因相關法律法規(guī)。從2001 年實施《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》，到2022 年6 月新印發(fā)的《國家級轉基因大豆品種審定標準（試行）》和《國家級轉基因玉米品種審定標準（試行）》，一系列法律法規(guī)的印發(fā)，對中國轉基因作物產業(yè)化的推進具有深遠影響。

我國對農業(yè)轉基因生物實行分階段安全評價管理制度，按過程分為實驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產性試驗、申請安全證書等5 個階段。這5 個階段，缺一不可，在任何一個階段發(fā)現任何一個對健康和環(huán)境不安全的問題，申請流程立即終止。依據《中華人民共和國種子法》《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》及《主要農作物品種審定辦法》等法律法規(guī)的規(guī)定，轉基因水稻品種獲得安全證書后，還需通過品種審定，并獲得種子生產經營許可證后，才可進入商業(yè)化生產應用。

自1997 年以來，我國僅對7 類農作物中的個別轉基因作物品種發(fā)放了轉基因生物安全證書（生產應用）。雖獲得安全證書，但截至2022 年底，我國獲批商業(yè)化種植的轉基因作物仍僅有抗蟲棉和抗病番木瓜，其余已發(fā)放安全證書的轉基因植物均未大面積商業(yè)化生產應用。據農業(yè)農村部數據顯示，2019 年我國轉基因棉花和番木瓜種植面積達320萬hm2，其中棉花占比約99%。除此之外，我國還批準了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、木瓜、甘蔗、苜蓿等國外研發(fā)的轉基因作物產品作為加工原料進入市場。

1.2 水稻轉基因技術水稻轉基因技術方法主要是通過將外源基因轉移到受體品種基因組中，經過篩選，從而獲得含目標性狀的水稻。常用的轉化技術有PEG 介導法、電激法、農桿菌介導法、花粉管通道法及基因槍法等（表2），其中利用天然具有轉化植物能力的革蘭氏陰性菌根癌農桿菌進行介導是目前水稻轉基因育種中最常用的方法[7]。

表2 主要水稻轉基因技術方法

2 水稻轉基因技術的應用

2.1 水稻抗蟲性改良蟲害是制約水稻生產的一個重要因素，常見的水稻害蟲主要是鱗翅目類和同翅目。對于水稻抗蟲性的改良，現有研究主要通過導入外源抗蟲基因，使得水稻達到較好的抗蟲效果，針對多種蟲害進行共同抑制。外源抗蟲基因主要有蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensisBerliner，簡稱Bt）殺蟲蛋白基因（如晶體蛋白基因cry和營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip）、馬鈴薯蛋白酶抑制劑II 基因pinII、蛋白酶抑制劑基因（如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI、修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因sck和大豆胰蛋白酶抑制劑基因SbTI）以及凝集素基因（如雪花蓮凝集素基因GNA）[13]。

2.1.1 轉基因蘇云金芽孢桿菌（Bt）水稻育種我國在抗蟲轉基因水稻研究方面起步較早，處于世界領先地位，我國首例獲農業(yè)部頒發(fā)安全證書批準商業(yè)化種植的轉基因糧食作物就是轉基因抗蟲水稻[14]。蘇云金芽孢桿菌（Bt）作為一種普遍存在的革蘭氏陽性和孢子形成細菌，可產生各種殺蟲蛋白。Bt轉基因水稻是目前主流的抗鱗翅目害蟲轉基因水稻，其優(yōu)點在于殺蟲蛋白只與特定害蟲體內的特異性受體結合才能激活殺蟲活性，致使害蟲死亡，對人體無害。并且，殺蟲蛋白在人體胃腸道酸性條件下不宜存活[15]。1989 年Yang 等[16]首次研發(fā)出Bt水稻植物，1993 年Fujimoto 等[17]將Bt的截短δ-內毒素基因cry1A（b）導入抗蟲水稻，轉基因水稻在mRNA 和蛋白質水平上有效表達了修飾的cry1A（b）基因，從而有效抵抗卷葉螟和條紋螟害蟲。轉基因Bt水稻品系開始逐漸發(fā)展，我國自主研發(fā)的轉cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻華恢1 號于2009 年獲得了我國的農業(yè)轉基因生物安全證書，并且于2018年通過了美國食品和藥品管理局的安全性審查程序[18-19]。不僅如此，我國還研發(fā)出了攜帶其他Bt殺蟲基因（如cry2A、cry1Ac、cry9C等）的轉基因水稻品系[20]。

近20 年的時間里，國際上Bt水稻作物的商業(yè)化為農民帶來了巨大的利益，但與此同時，許多昆蟲也對Bt毒性產生抗性。并且研究表明近10 年來，在國內棉鈴蟲和粉紅棉鈴蟲對表達Cry1Ac 的轉基因棉花也產生了抗性。對此，較好的解決方式就是通過基因堆疊策略，將兩種或多種Bt毒素進行堆積，從而起到殺死害蟲的作用。因為不同毒素的作用方式不同，毒素堆積方法不會引起交叉耐藥性。Li 等[21]通過使用種內混合播種的方式研究轉cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻對螟蟲、卷葉蟲和飛虱的影響，研究發(fā)現將轉基因Bt水稻與非轉基因親本系混合播種時，Bt水稻的混合比例越高，害蟲抑制效率越高。陳耕等[22]通過轉cry1Ab+cry1C雙價抗蟲水稻提高了水稻生長期全階段對二化螟的抗性。Ling 等[23]利用農桿菌介導法將cry2A*及hpt基因導入秈稻后研究發(fā)現，就抗蟲性角度來看，轉基因水稻對條螟、黃螟和稻葉螟具有較高的抗性。Cui 等[24]研究發(fā)現將鱗翅目和同翅目兩種危害水稻較為嚴重的抗蟲基因同時導入水稻中，可以獲得廣譜性抗蟲水稻。Xu 等[25]發(fā)現cry1Ab和Vip3A毒素融合蛋白轉基因水稻對亞洲水稻螟的抗性提高。

2.1.2 其他外源抗蟲基因水稻育種除Bt轉基因水稻外，蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因也能夠有效防治害蟲，但國內的相關研究較少。

蛋白酶抑制劑作為一類廣泛存在于植物中的蛋白質，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑主要影響鱗翅目害蟲的蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶抑制劑則通過抑制鞘翅目和半翅目昆蟲消化蛋白酶影響植食性昆蟲取食，達到防治害蟲的目的[26]。蛋白酶抑制劑不易產生抗性，抗蟲廣譜性更強，能夠彌補Bt殺蟲譜窄的不足。自1993 年首次發(fā)現番茄中蛋白酶抑制劑能夠有效降低煙草天蛾幼蟲的生長速率以來[27]，蛋白酶抑制劑基因在農作物抗蟲上的應用越發(fā)廣泛。國內現有關于蛋白酶抑制劑基因轉化水稻的研究，多是利用不同植物蛋白酶抑制劑基因實現抑制螟蟲的目的[28]。

植物凝集素是一種碳水化合物結合蛋白，能夠抑制甚至毒殺大部分昆蟲。通過轉基因技術將植物凝集素基因導入水稻中，使得水稻對同翅目害蟲如蚜蟲、稻飛虱等有明顯抗蟲作用。近年來，植物凝集素如半夏凝集素、天南星凝集素、雪花蓮凝集素等基因已經成功導入水稻、小麥等農作物中[29-30]，獲得了多種轉基因抗蟲植株。崔彥芹等[31]利用農桿菌介導法將半夏凝集素基因pta導入水稻恢復系輻恢838 中，獲得抗蟲效果較好的轉基因水稻。

轉基因抗蟲水稻應用于農業(yè)生產，能夠有效地降低勞動強度，節(jié)省大面積使用殺蟲劑所需的成本，同時降低農藥對益蟲及農田生態(tài)的破壞，減少農藥殘留，對我國的水稻生產具有重要意義。我國轉基因產品產業(yè)化遵循的是“非食用—間接食用—直接食用”原則，由于民眾對轉基因有疑慮和擔心，社會上對轉基因問題有爭論，導致在國外市場通過商業(yè)化許可的華恢1 號未能通過水稻品種審定。民眾對于轉基因食品的安全及轉基因生物的信心還有待加強。

2.2 水稻抗病性改良水稻病害作為影響水稻產量和質量的重要因素，通常根據其發(fā)病來源分為非侵染性和侵染性病害兩種。非侵染性病害主要是由于水稻在生長過程中生長環(huán)境不適宜或存在有害物質。如水稻育秧期因覆土過深、蓄水等，使得稻秧缺氧導致生理性爛秧。侵染性病害則是由病原微生物侵染寄主所引起的，具有一定的傳染性，常見的水稻病害有白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病和紋枯病等，以上病害對我國的水稻產量均造成較大損失且后期補救費時費力。因此，轉基因技術在抗病水稻育種具有重要意義。但抗病水稻的抗病性喪失、廣譜性抗病水稻的研發(fā)、轉基因水稻引起的土壤生態(tài)環(huán)境變化等仍是轉基因抗病水稻科研需要解決的現實問題。

2.2.1 抗白葉枯病轉基因水稻白葉枯?。╔anthomonas oryzaepv.oryzae）是一種由革蘭氏陰性菌水稻黃單胞菌引起的細菌性病害，會造成水稻枯死，一般發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)，近年來因為南繁制種的頻繁調運，病害逐步蔓延[32]。早在1967年Xa-1基因就被發(fā)現可以抵抗白葉枯病[33]，1998年Tu 等[34]用基因槍法將Xa21轉化優(yōu)良秈稻品種IR72，轉基因水稻獲得了白葉枯病抗性，研究還發(fā)現轉Xa21和Xa4兩種基因的IR72 對白葉枯病的抗性更強。章琦等[35]對普通野生稻進行水稻白葉枯病抗性鑒定時發(fā)現1 個新的抗病基因Xa23（t）。目前，水稻中挖掘到的白葉枯病抗性基因有Xa21、Xa23（t）、Xa27、Xa4、Xa5等[36]，可以作為培育高抗白葉枯病轉基因水稻的重要候選基因，從而培育出具有更高的水稻生長期全階段抗病水稻。除了對水稻之外，從其他生物中也獲得了抗白葉枯病基因，并應用于抗白葉枯病轉基因水稻培育研究中。戰(zhàn)園等[37]通過農桿菌介導法將莧色藜中抗白葉枯病的NDR1基因轉化入水稻中，并接種白葉枯病菌進行抗病鑒定，發(fā)現轉基因水稻的抗病性顯著提高。Sadumpati 等[38]將芥菜BjNPR1導入秈稻中發(fā)現，與野生型相比，轉基因水稻對白葉枯病的抗性增強。

2.2.2 抗稻瘟病轉基因水稻稻瘟病（Rice blast）是由絲狀真菌稻瘟病菌造成的真菌病害，也是我國南北稻田最嚴重的水稻病害之一。稻瘟病的初期癥狀雖不明顯，但傳播速度極快，防治費時費力[39]。轉基因抗稻瘟病水稻相關研究涉及的基因有幾丁質酶基因[40]（能夠降解稻瘟病菌細胞壁，破壞其細胞結構、干擾新陳代謝）、β-1，3 葡聚糖酶基因、核糖體失活蛋白基因、溶菌酶基因及葡萄糖氧化酶基因等[33]，已發(fā)現的稻瘟病主效抗性基因有Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pi40、Pi5、Pi39、Pi57等[41]。在最近的研究中，唐喆等[42]利用Gateway 基因重組技術將稻瘟病SEC11基因的干擾片段構建到Pbdl03載體上獲得HIGS 表達載體，并通過農桿菌介導轉化法導入水稻中，獲得了新的抗稻瘟病水稻，避免了抗病水稻的抗性易喪失的缺點。李嬌等[43]利用稻瘟病菌株Guy11 分別侵染水稻野生型（ZH11）和OsGLO1基因過表達（OsGLO1-OE）以及沉默（cas9-glo1）的轉基因水稻，研究發(fā)現OsGLO1提升了水稻稻瘟病抗性。Pokhrel 等[44]通過將大豆中獲得的異黃酮合酶基因（GmlFS1）導入到兩種不同品系的水稻中發(fā)現，60%以上植株表現出對稻瘟病抗性。

2.2.3 抗水稻紋枯病轉基因水稻紋枯?。⊿heath blight of rice）是由立枯絲核菌侵染引起的真菌性病害，可導致水稻產量損失10%～30%，嚴重時高達50%。防治水稻紋枯病對保證和提高水稻生產效益具有至關重要的作用[45]。紋枯病和稻瘟病同為真菌類病害，因此其轉基因技術操作類似。將來自哈茨木霉P1 菌株的內切幾丁質酶基因En導入水稻，可獲得具有明顯水稻紋枯病抗性的轉基因植株[14]。水稻的紋枯病抗性主要是由多種基因共同作用控制的數量性狀，相關主基因抗病的水稻種質較少[46]，野生近緣種開發(fā)出的ShB抗性基因[47]是如今研究紋枯病的表征分析非常重要的基因。近年來的研究中，Qi 等[48]通過從枯草芽孢桿菌中鑒定出的草酸脫羧酶基因OxDC，通過農桿菌介導導入水稻中，顯著提高轉基因水稻品系對稻瘟病和紋枯病的抗性，并且分析得出Glutaredoxin 和MADS box 編碼基因可能參與了OxDC抗水稻真菌病害的可能機制；Li等[49]發(fā)現了水稻抗病相關基因Os2H16，轉錄因子OsASR2特異性結合GT-1 順式元件并激活Os2H16的表達，顯著提高了水稻的抗病性。Maeda 等[50]通過對番茄DC3000 和真菌病原體Colletotrichum higginsianum進行篩選，獲得對紋枯病的抗病性基因BSR2，研究發(fā)現當水稻中導入BSR2基因后，水稻的抗病性顯著提高。

2.3 水稻抗除草劑改良雜草作為影響水稻產量的重要因素，不僅會在水稻生長過程中與水稻競爭消耗各種營養(yǎng)物質，而且會帶來更多蟲害問題。傳統的除草方式主要有人工除草、水旱輪作、合理灌溉以及化學除草等。應用除草劑對大部分雜草進行化學除草，抑制或殺滅雜草生長的效果明顯，但無法防治雜草稻，因為雜草稻與種植水稻生理特征等十分相似，所以上述方法都只能減輕或降低雜草帶來的危害，不能從根源上解決雜草問題[51]。近年來的研究熱點在如何培育出抗除草劑的新稻種，使得除草劑在解決雜草稻的同時，不影響栽培稻的生長?？钩輨┬碌痉N的培育有兩種方法，一種是將非轉基因抗除草劑水稻與其相關的除草劑配合使用，從而有效防治稻田雜草；另一種就是培育抗除草劑轉基因水稻。表3 總結了近年來抗除草劑轉基因水稻的相關研究及其目標基因等，由表3 可知，抗除草劑轉基因水稻的培育是直接將外源基因導入水稻中，如抗草銨膦、草甘膦、磺酰脲類等除草劑轉基因水稻，通過基因槍法或農桿菌介導法將植物中的bar、pat、EPSPS除草基因以及人藥物代謝酶細胞色素P450 基因導入水稻中獲得抗除草劑水稻。在抗除草劑轉基因水稻育種領域，我國的研究與國際水平還存在一定差距，應當在尋求技術創(chuàng)新的同時，大力推動轉基因技術培育抗除草劑水稻，促進我國農業(yè)現代化發(fā)展。

表3 抗除草劑轉基因水稻育種研究進展

3 總結

我國作為一個人口眾多的農業(yè)大國，總體看糧食安全基礎仍不穩(wěn)固，糧食安全形勢依然嚴峻，確保糧食安全十分重要。應用轉基因水稻育種技術提高水稻產量，可為促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展；轉基因抗蟲、抗病、抗除草劑水稻的推廣還將產生巨大的經濟和社會效益。我國水稻種質資源多樣性豐富、轉基因水稻技術研究深入，抗蟲、抗病及抗除草劑水稻轉基因研究方面取得顯著的進展。未來，轉基因水稻的主要研究方向應在于廣譜性抗病蟲及抗除草劑轉基因水稻的研發(fā)，做到多種病害、蟲害及除草劑的共同抵抗，綜合提高水稻產量及品質。但同時，我國轉基因水稻產業(yè)化還面臨著許多問題，如部分消費者對轉基因食品的負面態(tài)度、轉基因基礎研究有待加強等。

為實現轉基因水稻的產業(yè)化道路穩(wěn)步前進，未來轉基因水稻的發(fā)展應該著重關注以下幾個方面：（1）在加強監(jiān)管的前提下，對轉基因作物制種源頭有條件放開；（2）依法依規(guī)開展轉基因作物品種審定，允許獲得安全證書的轉基因作物商業(yè)化種植；（3）將轉基因技術和基因編輯技術進行協同監(jiān)管；（4）各省市等農業(yè)行政主管部門，應加強提高農業(yè)執(zhí)法隊伍理論知識水平，充分利用好農業(yè)農村部農作物種子質量監(jiān)督檢驗測試中心等技術力量，并加大快速檢測產品的應用；（5）加強宣傳，提高民眾對轉基因技術的認知水平，改變消費者對轉基因的負面認知態(tài)度。