金穎慧，閆國強，張俊艷，張 倩，丁洪青，董晶晶，李寶芬，馮娜娜，孫 越

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

骨質(zhì)疏松癥是以骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加為特征的一種全身慢性代謝性疾病，骨代謝失衡為其主要發(fā)病機制［1-2］。Wnt/β -聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路通過調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，影響骨形成和骨代謝，可達(dá)到改善骨質(zhì)疏松癥的作用［3］。堅骨膠囊為醫(yī)院制劑，主要由黃芪、三七、制川烏、制草烏、醋乳香、醋沒藥、川芎、紅花、膽南星、鱉甲、珍珠等組方，具有補腎益氣、祛瘀止痛作用，治療骨質(zhì)疏松癥療效較好，但作用機制尚不明確。前期研究證明，堅骨膠囊可有效預(yù)防大鼠骨質(zhì)疏松［4］，但其對骨質(zhì)疏松的治療效果尚不明確。故本研究中基于Wnt/β- catenin 信號通路探討了堅骨膠囊對骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨代謝的影響及其作用機制，為其治療骨質(zhì)疏松癥提供動物實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：MultiSkan3型全自動酶標(biāo)分析儀，F(xiàn)resco 型低溫冷凍離心機，均購于美國Thermo公司；056 型電泳儀（美國Bio - Rad 公司）；GENIUS 5K 型電動組織勻漿器（美國Fluka公司）；sky can1076型Micro-CT儀（上海賽新生物科技有限公司）。

試藥：堅骨膠囊（醫(yī)院制劑，批號為191107，規(guī)格為每粒0.35 g）；仙靈骨葆膠囊（國藥集團同濟堂＜貴州＞制藥有限公司，批號為Z20025357，規(guī)格為每粒0.3 g）；降鈣素（CT）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號為M - 0571R2），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）ELISA 試劑盒（批號為MM0689R2），骨保護素（OPG）ELISA 試劑盒（批號為M - 0115R1），生長激素（GH）ELISA 試劑盒（批號為MM - 0502R2），均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司；Wnt 檢測試劑盒（批號為YM2373），β-catenin 檢測試劑盒（批號為YM3403），糖原合成酶激酶- 3β（GSK - 3β）檢測試劑盒（批號為YM3507），骨形成蛋白-2（BMP-2）檢測試劑盒（批號為YM2507），均購于美國Immunoway公司。

動物：SPF 級Wistar 大鼠48 只，雌性，體質(zhì)量180～220 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（冀）2018-004，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃，相對濕度60%，自然光源，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水1 周，適應(yīng)環(huán)境。動物實驗經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（審查意見編號為2020KY038）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥

將48 只Wistar 大鼠隨機分為空白對照組（A 組，等量生理鹽水），模型對照組（B 組，等量生理鹽水），仙靈骨葆組［C組，468 mg/（kg·d）］，以及堅骨膠囊高、中、低劑量組［D1組、D2組、D3組，2 184，1 092，546 mg/（kg·d）］，各8 只。除A 組大鼠灌服純化水外，其余各組大鼠每日灌服維甲酸100 mg/ kg，連續(xù)4 周，建立骨質(zhì)疏松癥模型［5］；造模成功4 周后，各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。

1.2.2 觀察指標(biāo)

股骨微結(jié)構(gòu)及其指標(biāo)：取血后，各組大鼠脫頸處死，取左側(cè)股骨，用浸潤生理鹽水的紗布包裹，冷凍保存。采用Micro-CT儀掃描重建股骨，檢測遠(yuǎn)心端感興趣區(qū)股骨結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）、骨密度（BMD）、骨表面積與組織體積比（BV/TV）、骨表面積與骨體積比（BS/BV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

骨代謝生化指標(biāo)：于大鼠眼球后靜脈叢采血2 mL，離心，取血清，采用ELISA 檢測各組大鼠血清中CT，TRACP，OPG，GH的含量。嚴(yán)格按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟操作。

蛋白表達(dá)：取大鼠右側(cè)股骨，采用RIPA 蛋白抽提試劑提取組織中蛋白并定量，加入緩沖液煮沸變性，20μg上樣；300 mA 橫流轉(zhuǎn)模3 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min；加入Wnt1，β-catenin，GSK-3β，BMP-2一抗（稀釋度均為1∶1 000），室溫孵育10 min，4 ℃過夜，室溫孵育30 min；TBST 洗膜5 次，每次3 min；加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（稀釋度均為1∶10 000），室溫封閉2 h，TBST洗膜6次，每次3 min；采用電致化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒顯色、曝光、定影，采用凝膠定量分析軟件TotalLab Quant 讀取條帶的積分光密度（IOD）值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用Image軟件計算Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨微結(jié)構(gòu)及其指標(biāo)

A 組大鼠股骨遠(yuǎn)心端骨小梁多呈板狀，致密均勻；B 組大鼠股骨遠(yuǎn)心端骨小梁多呈桿狀，稀疏；C 組、D1組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)最完整，與A組接近。詳見圖1。

圖1 堅骨膠囊對骨質(zhì)疏松癥模型大鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of Jiangu Capsules on microstructure of femur in osteoporosis model rats

與A 組比較，B 組大鼠SMI 和Tb. Sp 均顯著升高（P＜0.05），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th 均顯著降低（P＜0.05）；與B組比較，C組和D1組大鼠SMI和Tb. Sp 均顯著降低（P＜0.05），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb.N，Tb.Th均顯著升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠股骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（，n=8）Tab.1 Comparison of microstructure indexes of femur of rats in each group（，n=8）

表1 各組大鼠股骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較（，n=8）Tab.1 Comparison of microstructure indexes of femur of rats in each group（，n=8）

注：與A組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表2和圖2同。Note：Compared with those in group A，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.1-2 and Fig.2）.

組別A組B組C組D1組D2組D3組Tb.Sp（μm）606.19±88.75 896.39±78.37△△638.48±34.75**650.58±79.72**833.49±92.12 853.40±88.18劑量［mg/（kg·d）］468 2 184 1 092 546 SMI 1.37±0.07 2.39±0.36△△1.50±0.41**1.45±0.29**2.08±0.53 2.21±0.44 BMD（g/cm3）0.23±0.05 0.15±0.02△△0.19±0.03*0.20±0.03*0.17±0.04 0.15±0.06 BV/TV（%）23.00±2.58 13.10±2.96△△18.87±2.50**18.06±4.19*15.09±4.18 14.20±3.09 BS/BV（mm -1）49.01±12.46 31.36±9.53△42.76±8.45*45.03±7.54*29.71±10.11 30.94±9.69 Tb.N（mm -1）1.82±0.64 1.24±0.34△1.75±0.52*1.70±0.26*1.46±0.74 1.30±0.46 Tb.Th（μm）98.09±8.15 85.00±5.91△△93.66±5.63*92.79±5.31*87.72±9.25 85.61±9.55

2.2 大鼠骨代謝生化指標(biāo)

與A 組比較，B 組大鼠血清CT，OPG，GH 水平均顯著降低（P＜0.01），TRACP 水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組和D1組大鼠血清CT，OPG，GH 水平均顯著升高（P＜0.05），TRACP水平顯著降低（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠骨代謝生化指標(biāo)比較（，ng/mL，n=8）Tab.2 Comparison of biochemical indexes of bone metabolism of rats in each group（，ng/mL，n=8）

表2 各組大鼠骨代謝生化指標(biāo)比較（，ng/mL，n=8）Tab.2 Comparison of biochemical indexes of bone metabolism of rats in each group（，ng/mL，n=8）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量［mg/（kg·d）］468 2 184 1 092 546 CT 4.48±1.21 1.87±0.58△△3.28±0.83**3.25±0.56**2.05±0.56 1.96±0.73 TRACP 8.40±1.16 14.53±2.78△△9.15±2.83**9.41±1.34**10.73±1.26*11.98±2.31 OPG 5.33±0.87 3.47±0.47△△4.42±0.97**4.77±1.17*4.26±1.02 3.94±0.61 GH 26.35±3.91 15.14±3.11△△23.91±2.60**24.05±3.04**20.20±4.45*16.62±3.14

2.3 大鼠股骨組織中蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組大鼠股骨組織中Wnt1，β-catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組和D1組大鼠股骨組織中Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 各組大鼠股骨組織中蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Protein expression levels in femoral tissue of rats in each group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥主要分為原發(fā)性、繼發(fā)性及特發(fā)性［6］。其中，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見，可分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老年性骨質(zhì)疏松癥。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中占比較高，屬中醫(yī)“骨痿”“骨痹”等范疇。腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展的重要病機［7］。堅骨膠囊具有補腎益氣、活血止痛之功效［8］。仙靈骨葆膠囊可促進成骨細(xì)胞增加與繁殖，抑制破骨細(xì)胞的相關(guān)通路而增加骨量，還可作用于免疫及血管生成相關(guān)通路，有助于改善骨微環(huán)境，治療骨質(zhì)疏松癥［9-10］。故本研究中選用仙靈骨葆膠囊為陽性對照藥物。

骨微結(jié)構(gòu)是反映骨質(zhì)疏松癥的重要指標(biāo)，SMI，BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th，Tb. Sp 等反映骨小梁結(jié)構(gòu)狀況，對骨質(zhì)疏松癥的判斷有重要作用［11］。由圖1 可知，D1組大鼠骨小梁呈板狀，與A 組接近；由表1可知，與B 組比較，D1組大鼠SMI 和Tb. Sp 均顯著降低（P＜0.01），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th 均顯著升高（P＜0.05），表明堅骨膠囊可明顯改善大鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)疏松。

骨質(zhì)疏松癥由骨轉(zhuǎn)換失調(diào)所致，CT，TRACP，OPG，GH 為常見骨代謝生化指標(biāo)，在骨轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用［12］。CT 是一種多肽類激素，參與調(diào)節(jié)鈣磷代謝，對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞有一定影響［12］。OPG 為骨形成標(biāo)志物，具有抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生、促進破骨細(xì)胞凋亡作用，進而影響骨代謝［13］，絕經(jīng)后女性雌激素水平降低，破骨細(xì)胞活性升高，機體轉(zhuǎn)為代償性骨吸收，骨形成增加，導(dǎo)致OPG 升高［14］。TRACP 為骨吸收標(biāo)志物，多數(shù)存在于肺泡巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞中，在正常人血清中以TRACP - 5a 和TRACP - 5b 的形式存在，其中TRACP - 5a 主要存在于炎性巨噬細(xì)胞中，TRACP - 5b 主要存在于破骨細(xì)胞中。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者雌激素水平降低，破骨細(xì)胞活躍，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致TRACP- 5b 水平升高。GH 具有促進細(xì)胞分化、增殖的作用［15］，通過影響破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞及成熟破骨細(xì)胞，達(dá)到調(diào)節(jié)骨吸收的作用，并能刺激前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖［16-17］。GH 分泌不足者的BMD 低于正常人，其分泌水平隨著年齡的增長而逐漸降低，BMD 也隨之降低［18］。由表2 可知，與B 組比較，D1組大鼠血清中CT，OPG，GH 水平均顯著升高，TRACP 水平顯著降低，提示堅骨膠囊通過調(diào)節(jié)骨代謝達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

當(dāng)激活Wnt/β- catenin 信號通路時，Wnts 會發(fā)生一系列下游事件的聯(lián)級反應(yīng)，使β- catenin 進入細(xì)胞核，啟動大量靶基因的轉(zhuǎn)錄［19］。Wnt 具有影響前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，成骨細(xì)胞外Wnt 蛋白與細(xì)胞膜上受體LRP5/ 6 結(jié)合后，通過與細(xì)胞質(zhì)中的Dsh蛋白（Dsh）、GSK - 3β、軸蛋白（Axin）、Dickkopf 相關(guān)蛋白（DKKs）等彼此作用形成二聚體，導(dǎo)致β- catenin 水平升高并進入細(xì)胞核，TCF/ LEF1 影響Runx 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）和Osterix 的表達(dá)，從而促進成骨細(xì)胞的增殖與分化［20-22］。BMP 在成骨細(xì)胞分化中具有重要作用，BMP - 2 激活后會與磷酸化的Smad1/ 5/ 8 和Smad4 形成復(fù)合物，將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞核以激活Runx2 的轉(zhuǎn)錄［23］。BMP 在參與成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的過程中，以多種機制促進Wnt /β- catenin 信號的傳導(dǎo)［24］。由圖2可知，與B 組比較，D1組大鼠股骨組織中Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，表明堅骨膠囊可能通過影響Wnt/β- catenin 信號通路促進骨形成，抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨代謝，進而減少骨量丟失。

綜上所述，堅骨膠囊能有效增強骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的BMD 和骨強度，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，其作用機制可能與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。