任 瑩，孫志晴，李 智，王鑫瑞，李 喬

（安徽省界首市中醫(yī)院，安徽 阜陽(yáng) 236600）

十一味定喘口服液為我院呼吸與危重癥科針對(duì)痰熱內(nèi)蘊(yùn)、風(fēng)寒外束之哮喘等擬訂的方劑，清痰熱，外散風(fēng)寒，宣降肺氣而平哮喘，具有宣肺降氣、清熱化痰功效。方中，黃芩性寒，味苦，主歸肺經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效。藥理學(xué)研究表明，黃芩苷具有顯著的抗呼吸道合胞病毒［1-2］、抗氧化［3-4］、抑菌［5-6］和抗炎活性［7］。為有效控制其質(zhì)量，保證治療效果，本研究中建立了桑白皮、麻黃、甘草的薄層色譜鑒別法，并采用高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Alliance e2695 型高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），配有紫外檢測(cè)器；225D-1CN 型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為0.01 mg）；硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠，煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；ZF-2型三用紫外儀（上海金鵬分析儀器有限公司）；KQ-400E型旋鈕式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

麻黃對(duì)照藥材（批號(hào)為121051 - 201606），桑白皮對(duì)照藥材（批號(hào)為121124-202109），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120904-202021），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202122，純度為94.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芩飲片（亳州滬譙藥業(yè)有限公司，批號(hào)為2201140102）；甲醇（色譜純，美國(guó)天地有限公司）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；磷酸（色譜純）；甲醇、碳酸鈉、鹽酸、乙酸乙酯、氨水、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、正丁醇、冰醋酸、茚三酮、乙醚、二氯甲烷、硫酸均為分析純；十一味定喘口服液（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為22062301，22062401，22062501）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

桑白皮［8-9］：取3批（批號(hào)分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至近干，加飽和碳酸鈉溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液加稀鹽酸調(diào)pH 至1～2，靜置30 min，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，水浴揮干，以1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺桑白皮的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺桑白皮的陰性對(duì)照品溶液。取桑白皮對(duì)照藥材2 g，同法制備桑白皮對(duì)照藥材溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，用石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（6∶4，V/V）展開，105 ℃下加熱2 min顯色清晰，立即置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與桑白皮對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

麻黃［10］：取3 批（批號(hào)分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，加濃氨試液10滴，以三氯甲烷萃取2次，每次加三氯甲烷15 mL，分取三氯甲烷層并合并，水浴蒸干，加無(wú)水乙醇2 mL 使溶解，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺麻黃的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺麻黃的陰性對(duì)照品溶液。取麻黃對(duì)照藥材1 g，加濃氨試液10滴，加三氯甲烷10 mL，水浴回流1 h，濾過(guò)，取三氯甲烷液，蒸干，加無(wú)水乙醇3 mL 使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502薄層色譜法，取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，用正丁醇- 冰醋酸-水（4∶1∶1，V/V/V）展開，噴以茚三酮試液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與麻黃對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 B。

甘草［11］：取3 批（批號(hào)分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，加乙醚萃取3 次，每次10 mL，棄去乙醚液，水層用正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次60 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，加甲醇3 mL 使溶解，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺甘草的陰性對(duì)照品溶液。取甘草對(duì)照藥材1 g，加乙醚40 mL，水浴回流1 h，濾過(guò)，藥渣加甲醇30 mL，水浴回流1 h，濾過(guò)，取甲醇液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，加正丁醇萃取3 次，每次20 mL，合并萃取后的正丁醇液，再用等體積（60 mL）水洗滌3次，將洗滌后的正丁醇液蒸干，加甲醇3 mL 使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，用二氯甲烷- 甲醇- 水（40∶10∶1，V/V/V）展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹或105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別于日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與甘草對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 C1和圖1 C2。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［12-14］

色譜柱：依利特Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備［15-18］

取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含70μg 的溶液，即得對(duì)照品溶液。精密量取樣品2 mL，置100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，混勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。按樣品制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺黃芩的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜圖中，黃芩苷峰分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察［19-20］：取質(zhì)量濃度為0.789 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.157 8，0.078 9，0.039 45，0.019 73，0.009 865 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 3.480 8×107X-6.573 8×104，r=0.999 8（n=5）。結(jié)果表明，黃芩苷的質(zhì)量濃度在0.009 865～0.157 800 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為78.9μg/mL 的對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.17%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為22062301）6 份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中黃芩苷的平均含量為3.854 mg/mL，RSD為0.50%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為22062301），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別于配制后0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為22062301）6 份，分別精密吸取1.00 mL，置100 mL 容量瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.843 3 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液5 mL，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取濾液。按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定及限度確定

取黃芩飲片（批號(hào)為2201140102），按2020年版《中國(guó)藥典（一部）》黃芩飲片項(xiàng)下方法測(cè)定黃芩苷含量為11.92%。取3 批（批號(hào)分別為22062301，22062401，22062501）樣品，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得樣品中黃芩苷含量分別為3.82，3.83，3.82 mg/mL。十一味定喘口服液中每1 mL 含黃芩飲片0.084 g，按投料的黃芩飲片計(jì)算，每1 mL 含黃芩苷10.01 mg。根據(jù)3批樣品的實(shí)測(cè)含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率為38.16%～38.26%，差異不大，表明工藝較穩(wěn)定。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，按干燥品計(jì)算，黃芩飲片中含黃芩苷（C21H18O11）應(yīng)不低于8.0%（80 mg/ g），故成品含量不低于2.57 mg/ mL。綜合考慮，暫定黃芩苷含量不低于2.57 mg/mL。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別藥味與對(duì)照藥材選擇

十一味定喘口服液由麻黃、炒白果、蜜桑白皮、黃芩等11味中藥材組方，其中白果、苦杏仁、酸棗仁、紫蘇子、款冬花等藥味暫無(wú)合適的薄層色譜鑒別方法。桑白皮、麻黃、甘草、黃芩的薄層色譜鑒別方法的專屬性較好，故薄層色譜中僅對(duì)桑白皮、麻黃、甘草進(jìn)行定性鑒別。中藥復(fù)方制劑中各藥味定性鑒別難度較高，需嘗試多種方法，消耗大量對(duì)照品和（或）對(duì)照藥材，本研究中均采用價(jià)格相對(duì)低廉且能提供更多鑒別信息的對(duì)照藥材為參照物，以降低檢驗(yàn)研發(fā)的成本。

3.2 含量測(cè)定指標(biāo)成分選擇

方中，麻黃疏散風(fēng)寒、宣肺平喘，白果斂肺定喘，兩藥配伍，斂收結(jié)合，既能增強(qiáng)平喘之功，又可宣肺而不耗氣，斂肺而不留邪，共為君藥；桑白皮瀉肺平喘，黃芩清熱化痰，兩藥配伍，可消內(nèi)蘊(yùn)之痰熱，共為臣藥。參考2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》，麻黃含量測(cè)定成分為鹽酸麻黃堿和偽麻黃堿，需用特殊色譜柱且損耗較快，流動(dòng)相配制煩瑣，檢測(cè)成本較高，故選用操作簡(jiǎn)便、分離效果好的薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別；2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中無(wú)白果的含量測(cè)定方法。故未選擇麻黃、白果進(jìn)行含量測(cè)定。臣藥黃芩的有效成分黃芩苷較穩(wěn)定，4 ℃密封儲(chǔ)存1年的峰面積變化不大，故選擇黃芩苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.3 色譜條件選擇

黃芩苷在甲醇中溶解度較小，故配制對(duì)照品溶液時(shí)濃度不宜過(guò)大，必要時(shí)可進(jìn)行超聲處理。采用高效液相色譜法對(duì)黃芩苷進(jìn)行定量時(shí)，以甲醇- 水為流動(dòng)相時(shí)的色譜峰對(duì)稱度較差，換為0.1%磷酸水溶液后色譜峰峰形明顯改善。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于十一味定喘口服液的質(zhì)量控制。含量限度暫定為不低于2.57 mg/mL。僅以3批制劑計(jì)算轉(zhuǎn)移率，批次較少，結(jié)果有一定局限性，后期可收集更多批次的樣品，擴(kuò)大檢測(cè)樣本量，制訂更合理的含量限度。