王啟硯，劉冬梅，宋 軍

（湖北省荊門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)所，湖北 荊門 448000）

玳玳花為蕓香科植物玳玳花Citrus aurantiumL.var.amaraEngl. 的干燥花蕾，主要分布于我國南部各地，在浙江、江蘇、廣東等地均有栽培，其具有理氣寬胸、開胃止嘔的功效，主要用于胸脘脹悶、惡心嘔吐、食欲不振等癥［1］。玳玳花主要含有黃酮類、酚酸類、香豆素、木脂素類、脂肪酸、萜類等成分［2-4］，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有揮發(fā)油［5-6］的總量測定方法，文獻(xiàn)［7-8］對玳玳花果實(shí)（枳實(shí)和枳殼）的質(zhì)量研究較多。本研究中建立了測定玳玳花中柚皮苷和新橙皮苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，旨在為玳玳花的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific 公司）；BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.01 mg/ 0.1 mg）；AS10200A 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；TTL-10B 型純水機(jī)（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

13 批玳玳花藥材樣品均購自A 公司，批號分別為210410 - 210412，210506 - 210507，210619 - 210620，220622 - 210624，20210616，20210701，20210621），經(jīng)湖北省荊門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)所宋軍副主任中藥師鑒定均為正品；柚皮苷對照品（批號為110722 -201312，含量為100%），新橙皮苷對照品（批號為111857 - 201102，含量為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［9-12］

色譜柱：Akasil-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL / min；檢測波長：283 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取玳玳花藥材細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

分別取柚皮苷和新橙皮苷對照品11.04，11.86 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為220.8，236.3 μg/ mL 的對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液各2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.2 項(xiàng)下對照品貯備液0.5，1，2，4，8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以柚皮苷和新橙皮苷的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y柚= 28.788X柚+0.030 3、Y新=32.452X新+0.020 0（r=1.000 0，n=5）。結(jié)果表明，柚皮苷和新橙皮苷進(jìn)樣量分別在0.110 4～1.766 4μg、0.118 1～1.890 0μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.78%和1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

中間精密度試驗(yàn)：取樣品0.20 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在Dionex UltiMate 3000型、SpectraSYSTEM P2000 型、Waters e2695 Separations Module型高效液相色譜儀上測定，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷含量的RSD分別為1.48%和1.52%（n= 3），表明不同儀器對精密度影響較小。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.65%和0.30%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為210410）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷平均含量分別為3.84%和8.29%，RSD分別為1.75%和2.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為210410）0.10 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入柚皮苷和新橙皮苷對照品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

耐用性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別用Akasil C18柱、AE.Licrum C18柱、Dionex C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果柚皮苷和新橙皮苷含量的RSD分別為1.60%和0.98%（n= 3），表明柚皮苷和新橙皮苷在不同色譜柱上的測定結(jié)果無明顯差異。

2.4 樣品含量測定

取13 批玳玳花藥材樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中柚皮苷和新橙皮苷含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Results of the content determination of naringin and neohesperidin in samples（%，n=3）

3 討論

柚皮苷和新橙皮苷均為黃酮類化合物，新橙皮苷可作用于胃腸道平滑?。?1］，兩者含量作為HPLC法［9-12］檢測玳玳花質(zhì)量的指標(biāo)具有一定意義。以甲醇［9，12］為提取溶劑，曾采用30，60，90，120 min的超聲波提取和水浴回流提取，結(jié)果水浴回流提取90 min 時(shí)指標(biāo)成分的得率較高；柚皮苷和新橙皮苷紫外最大吸收波長為分別為283，284 nm，故檢測波長選擇283 nm；以乙腈- 0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）［8］為流動相，能很好地將柚皮苷和新橙皮苷同其他組分分離，與最鄰近峰的分離度約為1.7（＞1.5），符合2020年版《中國藥典（四部）》通則 0512 的要求。故最終確定2.1 項(xiàng)下色譜條件。

本研究中建立的HPLC 法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于玳玳花的質(zhì)量控制。