黃凱偉，任應(yīng)宗△，張 輝，譚 沛，張麗君，鄭曉英，趙偉志

（1. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110； 2. 華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

化橘紅（柚）來源于蕓香科植物柚Citrus grandis（L.）Osbeck 未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有散寒、燥濕、利氣、消痰的功效，用于治療風(fēng)寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等［1］，主要含有黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油、多糖等成分［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，化橘紅具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、防治糖尿病患者心肌功能損傷等作用，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值［3］。中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下由單味中藥飲片經(jīng)水提取、固液分離、濃縮、干燥、制粒而制得的顆粒，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配，供患者沖服的制劑［4］。國家藥典委員會(huì)2021 年發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（以下簡稱《要求》）提出，中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)研究中應(yīng)對(duì)藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體提取物和成品配方顆粒的特征圖譜或指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)性研究［5-7］，以保證其顆粒的質(zhì)量符合傳統(tǒng)湯劑的要求。目前，有關(guān)化橘紅（柚）藥材的化學(xué)成分測(cè)定和特征圖譜研究較多，且方法多集中于超高效液相（UPLC）法［8-10］，尚無對(duì)化橘紅（柚）及其制劑產(chǎn)品特征圖譜相關(guān)性研究的報(bào)道。為此，本研究中建立了化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的UPLC 指紋圖譜，對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討化橘紅（柚）配方顆粒制備過程中化學(xué)成分間的差異，確保顆粒劑與湯劑質(zhì)量的一致性，旨在為化橘紅（柚）配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent Q - TOF 6545 LC/ MS 型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（美國Agilent 公司）；XSE205 型分析天平（精度為萬分之一），ME36S 型分析天平（精度為百萬分之一），均購于瑞士Mettler Toledo 公司；SK5200H 型數(shù)控超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722 - 201815，含量為91.7%），野漆樹苷對(duì)照品（批號(hào)為111919-201804，含量為95.5%），化橘紅（柚）對(duì)照藥材（批號(hào)為121165 -201804），均購于中國食品藥品檢定研究院；維采寧-2對(duì)照品（佛山奧羽生物科技有限公司，批號(hào)為AY230001-202208，含量為98.0%）；橙皮內(nèi)酯水合物對(duì)照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)為ST58400205，含量為95.0%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純；15 批化橘紅（柚）藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定均為正品，藥材飲片樣品信息見表1。

表1 15批藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒樣品信息Tab.1 Information of 15 batches of Citri Grandis Exocarpium and its decoction slices，standard decoction and dispensing granules

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：CORTECSUPLC?T3柱（100 mm×2.1 mm，16μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-2%乙酸溶液（B），梯度洗脫（程序見表2）；流速：0.2 mL/ min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：315 nm。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）；掃描方式：正負(fù)離子模式；掃描范圍：全質(zhì)量掃描，質(zhì)荷比（m/z）50～1 700；鞘氣溫度：350 ℃；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 L/min；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：1 000 V，；解電壓：175 V；錐孔電壓：60 V；碰撞能量（CE）：40 eV。

2.2 樣品制備

15 批化橘紅（柚）飲片（編號(hào)為YP1 - YP15）嚴(yán)格按2020 年版《中國藥典（一部）》化橘紅（柚）項(xiàng)下飲片炮制規(guī)定進(jìn)行炮制［1］。15 批化橘紅（柚）飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)為BT1 - BT15）嚴(yán)格按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》［11］、《要求》［6］中煎藥方法進(jìn)行制備，取化橘紅（柚）飲片，提取制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑，根據(jù)《要求》進(jìn)行低溫減壓濃縮，冷凍干燥，得化橘紅（柚）飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。15 批化橘紅（柚）配方顆粒（編號(hào)為PFKL1 -PPFKL15）由水提取，加麥芽糊精輔料，經(jīng)濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

2.3 溶液制備

取柚皮苷對(duì)照品和野漆樹苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.6 mg、25μg的混合對(duì)照品溶液。

取飲片樣品粉末（過4 號(hào)篩）0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，加熱回流45 min，放冷，搖勻，濾過，蒸干，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得飲片供試品溶液。取標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒樣品各0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒供試品溶液。

取麥芽糊精輔料，按配方顆粒制備方法制備陰性顆粒樣品；取樣品0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得陰性顆粒對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.3項(xiàng)下配方顆粒供試品溶液、陰性顆粒對(duì)照品溶液各1μL，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性樣品無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：取配方顆粒樣品（批號(hào)為PFKL3），按2.3 項(xiàng)下方法制備配方顆粒供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，以5 號(hào)峰柚皮苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。

中間精密度試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下配方顆粒供試品溶液2 份，分別由2 名檢驗(yàn)員在不同時(shí)間用同一臺(tái)設(shè)備，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)峰柚皮苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下配方顆粒供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，36，48 h時(shí)按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)峰柚皮苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%（n=9），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取配方顆粒樣品（編號(hào)為PFKL3）6份，依法制備配方顆粒供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以5號(hào)峰柚皮苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5 UPLC 指紋圖譜建立與相似度評(píng)價(jià)

指紋圖譜建立：分別取15批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒，按2.3項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配，確定化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒均有9 個(gè)共有峰（圖2 至圖3）。根據(jù)樣品多級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)9個(gè)目標(biāo)峰進(jìn)行鑒定，明確了峰2至峰9的相對(duì)分子質(zhì)量、分子式和化學(xué)成分（表3），并通過與對(duì)照品圖譜比對(duì)，確定了4號(hào)峰、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰的保留時(shí)間分別與維采寧-2、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內(nèi)酯水合物的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。

圖3 超高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.3 UPLC reference fingerprints

表3 共有峰化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.3 Identification results of chemical components of common peaks

相似度評(píng)價(jià)：分別將15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版），分別計(jì)算各批次化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見表4。可見，15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其相應(yīng)對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.900，表明不同批次化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的質(zhì)量較穩(wěn)定。

表4 15批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.4 The fingerprint similarity results of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

共有峰相關(guān)性分析：特征選擇通過衡量特征與類別的相關(guān)性，剔除不相關(guān)特征和冗余特征，有助于提高分類準(zhǔn)確率。采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45 個(gè)樣品各共有峰的峰面積占比，即各共有峰峰面積占共有峰總面積的比例為變量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析。結(jié)果見表5。可見，化橘紅（柚）飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑比較，峰3、峰7、峰9 具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），其他共有峰相關(guān)性不顯著；化橘紅（柚）標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒比較，9 個(gè)峰均具有極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）。

表5 15批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.5 Correation anlasis results of common peaks of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

聚類分析：采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒45 個(gè)樣品共有峰峰面積為變量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4?？梢?，當(dāng)距離為25 時(shí)，45 個(gè)樣品可聚為兩大類。其中，編號(hào)為YP1、YP2、YP7、YP8、YP9、YP10、YP13、YP14、YP15的樣品聚為一類；化橘紅（柚）標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒之間無明顯差異，可聚為一類。

圖4 15批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒特征圖譜層次聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of hierarchical cluster analysis for 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

主成分分析：采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45 個(gè)樣品各共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值（Zi）進(jìn)行主成分分析，主成分結(jié)果以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)提取得到3個(gè)主成分，計(jì)算得特征值與方差貢獻(xiàn)率（表6）、主成分因子載荷矩陣（表7）。可見，前3 個(gè)主成分因子累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.863%，說明這3 個(gè)主成分能預(yù)測(cè)化橘紅（柚）指紋圖譜特征峰指標(biāo)的主要信息。主成分1的特征值為3.823，方差貢獻(xiàn)率為42.478%，載荷較高的峰有峰1、峰2、峰4（維采寧-2）、峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷），表明這5 個(gè)峰主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值為2.439，方差貢獻(xiàn)率為27.101%，載荷較高的峰有峰3、峰7（橙皮內(nèi)酯水合物）、峰8，表明這3 個(gè)峰主要反映主成分2 的信息；主成分3 的特征值為1.196，方差貢獻(xiàn)率為13.284%，載荷較高的峰有峰9，表明該峰主要反映主成分3 的信息。

表6 15批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒主成分分析特征值與方差貢獻(xiàn)率Tab.6 Characteristic value and variance contribution rate of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

表7 15批飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Tab.7 Factors loading matrix of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）：以15批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒共45 個(gè)樣品各共有峰峰面積為變量，采用OPLS-DA模式識(shí)別方法進(jìn)行樣品特征圖譜差異性分析，獲得組間成分差異貢獻(xiàn)率較大的共有峰。采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLS - DA模型擬合，結(jié)果45 個(gè)樣品分為3 類。以變量重要性投影值（VIP）大于1.0 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異特征峰，分別為峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷）和峰7（橙皮內(nèi)酯水合物），說明這3個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)成分是影響飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒質(zhì)量的差異性成分。詳見圖5和圖6。

圖5 OPLS-DA分析的Score得分圖Fig.5 The Score plot of OPLS - DA analysis

圖6 OPLS-DA模型中各共有特征峰的VIP值Fig.6 VIP values of common charasteristic peaks in OPLS-DA model

3 討論

按照《要求》，中藥配方顆粒應(yīng)對(duì)藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、中間體提取物和成品配方顆粒的特征圖譜或指紋圖譜相關(guān)性進(jìn)行研究。中藥指紋圖譜是一種綜合、全面的評(píng)價(jià)技術(shù)，可全面反映中藥化橘紅（柚）所含化學(xué)成分的種類與質(zhì)量水平。故本研究中通過建立化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒的UPLC 指紋圖譜，對(duì)三者的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。共確定9 個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中4 個(gè)共有峰，即峰4 為維采寧-2、峰5 為柚皮苷、峰6為野漆樹苷、峰7 為橙皮內(nèi)酯水合物。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，15 批化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒均與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜的相似度較高（＞0.900），表明不同批次的化橘紅（柚）整體的化學(xué)成分具有較好的一致性?；瘜W(xué)模式識(shí)別研究結(jié)果顯示，不同批次化橘紅（柚）飲片較分散，主要由產(chǎn)地不同、特征成分的含量積累不同造成的；不同批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒之間較緊密，表明配方顆粒生產(chǎn)制備過程中，各特征峰均能穩(wěn)定性傳遞，沒有發(fā)生明顯降解或增加，制得的配方顆粒的質(zhì)量與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑基本一致。飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒之間的差異較大，可能是由于供試品制備方法差異導(dǎo)致了各特征峰的化學(xué)成分含量的差異。但從特征峰的個(gè)數(shù)上分析，表明飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒在化學(xué)成分的一致性。

OPLS - DA 將45 個(gè)樣品分為3 類，并篩選出3 個(gè)VIP 大于1的差異性成分，分別為峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷）和峰7（橙皮內(nèi)酯水合物）。因此，計(jì)劃下一步從這3 個(gè)特征性成分出發(fā)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒含量的相關(guān)性。

綜上所述，本研究中建立的方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于化橘紅（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的指紋圖譜分析?；偌t（柚）飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒相關(guān)性較好，可有效控制化橘紅（柚）配方顆粒生產(chǎn)制備過程中從原料到成品階段的質(zhì)量。