歐小英，歐陽敏

（1.寧遠縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南 寧遠 425600；2.寧遠縣桐山街道農(nóng)業(yè)綜合服務中心，湖南 寧遠 425600）

近年，我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展迅速，品種多、數(shù)量大、養(yǎng)殖模式多樣化[1]，集約化、現(xiàn)代化、生態(tài)化健康養(yǎng)殖模式是未來發(fā)展趨勢。我國是世界上第一養(yǎng)禽大國，但還不是養(yǎng)禽強國[2]。禽病是影響?zhàn)B禽業(yè)健康發(fā)展最主要的因素，不僅影響禽類的存活率和生長發(fā)育速度，而且還影響家禽的產(chǎn)蛋率和種禽質(zhì)量[3]。

禽病防控面臨的形勢依然嚴峻，做好禽病綜合防控工作至關重要，其中疫苗接種是最有效的手段之一[4-5]。新城疫和禽流感是目前對養(yǎng)禽業(yè)危害比較嚴重的兩種疫病[6-7]，為了探討這兩種疫病免疫預防時的相互影響，本試驗將市售的雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗與其他禽類疫苗同時接種雞，于接種后不同時間進行血清抗體監(jiān)測，并與單獨接種其他禽類疫苗雞的血清抗體進行對比，了解不同疫苗對雞免疫學功能的影響，現(xiàn)將試驗結果報道如下。

1 材 料

1.1 試驗疫苗

兩批雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota 株+M41 株+YBF003 株），以下簡稱“新支流三聯(lián)”（批號為180010900 和180020900），市售，哈爾濱某公司產(chǎn)品。

1.2 注射器

1 mL 注射器，購自上海治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗蛋雞

14日齡健康海蘭褐蛋雞，市售。

1.4 疫苗、抗原及血清

重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6株+Re-8株），批號為20180401，市售。

禽流感病毒H5 亞型血凝抑制試驗抗原與陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)有限公司。

2 方 法

2.1 試驗分組

取14 日齡海蘭褐蛋雞40 只，分成4 組，每組10 只。第1 組：頸部皮下注射新支流三聯(lián)（批號為180010900）疫苗，注射劑量為0.3 mL·只-1，同時肌肉注射禽流感H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第2組：頸部皮下注射新支流三聯(lián)（批號為180020900）疫苗，注射劑量為0.3 mL·只-1，同時肌肉注射禽流感H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第3 組：肌肉注射重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第4組（對照組）：不接種任何疫苗。試驗雞于疫苗注射后14、21、28天逐只采血，分離血清，進行H5亞型Re-6株禽流感HI抗體效價測定，并通過比較各組HI 效價的幾何平均值，來分析對雞免疫學功能是否存在影響。試驗分組情況見表1。

表1 試驗分組

2.2 檢測方法

2.2.1 臨床觀察

注射疫苗前及注射后28 d，每天系統(tǒng)觀察試驗雞的精神狀態(tài)、行為活動、糞便狀況、采食和飲水情況。

2.2.2 HI抗體效價測定

2.2.2.1 血凝抗原工作液配制

血凝抗原凝集價測定：取禽流感病毒H9 亞型血凝抑制試驗抗原在96 孔V 型微量反應板進行血凝試驗，每孔加25 μL PBS（0.1 mol·L-1，pH7.0～7.2），第1 排加25 μL 血凝抗原，并進行2～4 個重復孔，然后進行2倍系列稀釋，稀釋后每孔再加入25 μL PBS，最后再加入1%雞紅細胞懸液25 μL，在微量振蕩器上混勻，室溫靜置20～40 min，當對照孔中的紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。以使紅細胞100%凝集的最高稀釋倍數(shù)作為判定終點。各成分量及加樣順序詳見表1。

血凝抗原工作液（4 HAU）配制：根據(jù)測定的血凝抗原凝集價，按照公式計算配制4 個血凝單位（即4 HAU）工作液稀釋倍數(shù)，即稀釋倍數(shù)=血凝抗原凝集價/4。如血凝抗原凝集價為1∶256，則配制4 HAU 血凝抗原工作液時應用PBS 稀釋64 倍（256/4=64）。按照計算出的倍數(shù)用PBS 配制4 HAU 血凝抗原工作液。

4 HAU血凝抗原工作液檢驗：將配制好的4 HAU血凝抗原工作液用PBS 稀釋，使其稀釋度為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，從每一稀釋度中取出25 μL，加入25 μL PBS，再加入1%雞紅細胞懸液25 μL，振蕩混勻，室溫靜置20～40 min 后判定結果。如1∶4 稀釋為100%紅細胞凝集終點，表明配制的是4 HAU血凝抗原工作液；如100%紅細胞凝集終點是1∶5 或1∶6，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液實際上高于4 個單位；如100%紅細胞凝集終點是1∶2 或1∶3，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液實際上低于4個單位。應根據(jù)檢驗結果適當調(diào)整，使抗原工作液為4 HAU血凝抗原工作液。

2.2.2.2 紅細胞凝集抑制（HI）試驗

各成分量及加樣順序詳見表2。

表2 微量血凝抑制試驗（微量法）術式μL

待檢血清樣品稀釋：第1～11 孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。在第1孔加入25 μL待檢血清樣品，充分混勻后吸取25 μL 加至第2 孔，依次2 倍稀釋至第10 孔，從第10 孔吸取25 μL棄去。

加入4 HAU 血凝抗原工作液：第1～11 孔均加入25 μL 的4 HAU 血凝抗原工作液，第12 孔不加4 HAU 血凝抗原工作液作為對照，在室溫（20～25 ℃）下靜置20～40 min進行中和。

加入紅細胞：每孔加入25 μL 1%（V/V）的雞紅細胞懸液。

血凝抑制反應：將反應板在振蕩器上振蕩1～2 min 或輕扣反應板混合反應物，在室溫（20～25 ℃）下靜置20～40 min，根據(jù)血凝圖像判定結果。對照紅細胞將呈顯著紐扣狀。（每次測定時應設陰性血清對照和已知HI 抗體效價的陽性血清對照）

結果判定：將微量板傾斜45°。當陰性對照血清HI 效價不高于1∶4（微量法）、陽性對照血清HI效價與已知效價相比誤差不超過1個效價值時，試驗方法成立。若紅細胞沉淀呈淚珠狀流淌，判為HI陽性；若紅細胞在孔底均勻分布或呈鋸齒狀凝集，判為HI陰性。以完全抑制4 HAU血凝抗原工作液的最高稀釋倍數(shù)判為該待檢血清樣品的HI效價。

3 結果與分析

3.1 臨床觀察結果

試驗雞臨床表現(xiàn)見表3。

表3 不同組別試驗雞臨床觀察結果

從表3 可以看出，試驗觀察期內(nèi)，4 組試驗雞全部健活，精神良好，采食、飲水、行為和糞便等未見異常，無其他全身不良反應。

3.2 HI抗體效價檢測

HI抗體檢測結果見表4。

表4 各組不同時間點H5亞型禽流感HI抗體效價測定結果

從表4 可以看出，注射后14、21 和28 d 同時接種兩種疫苗，第1 組（新支流三聯(lián)180010900批）雞血清中H5 亞型禽流感HI 抗體效價分別為1∶68.6、1∶207.9 和1∶415.6，第2 組（新支流三聯(lián)180020900批）雞血清中H5亞型禽流感HI抗體效價分別為1∶68.6、1∶207.9 和1∶445.7；第三組單獨注射重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8 株）組雞血清中H5 亞型禽流感抗體效價分別為1∶64.0、1∶194.0 和1∶388.0，健康對照組雞血清中H5亞型禽流感HI抗體效價均不高于1∶24.3。說明接種2種疫苗試驗雞血清H5亞型禽流感HI抗體效價與單獨注射重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8 株）組無明顯差異，證明不同疫苗免疫對雞免疫學功能無影響。

4 討 論

在家禽養(yǎng)殖過程中會面臨各種疾病的挑戰(zhàn)，藥物治療存在不對癥、不及時、效果差等諸多問題，常常會造成巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫是目前較為常用且有效的手段，但預防不同的疫病要使用不同的疫苗，不同疫苗的同時接種偶爾會存在相互干擾的情況，如張大俊[8]進行了羊痘疫苗與小反芻獸疫疫苗同時或單獨免疫效果比較及分析，結果羊痘疫苗和小反芻獸疫疫苗同時免疫促進了小反芻獸疫疫苗的抗體水平，抑制羊痘的抗體水平，表明羊痘和小反芻獸疫疫苗同時免疫不利于羊痘疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生較好的免疫應答。但也有相當多的研究表明，不同疫苗同時多點接種，免疫效果不受影響，孟麗軍等[9]進行了豬口蹄疫、豬瘟、高致病性藍耳病三種疫苗不同組合同時分點免疫的效果觀察，結果表明豬口蹄疫、豬瘟、高致病性藍耳病3 種疫苗同時分點免疫，免疫副反應率比較低，特別是進行二免、三免后抗體效價更高。華利忠等[10]進行了雞滑液囊支原體活疫苗（MS-H 株）同時免疫對新支二聯(lián)活疫苗免疫效力影響的調(diào)查，結果表明同時免疫滑液囊支原體活疫苗并未對新支二聯(lián)活疫苗的免疫效力產(chǎn)生影響。沈亞菊等[11]進行了重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗和雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒?。á袢? 型）三聯(lián)滅活疫苗聯(lián)合免疫效果研究，結果表明兩種禽流感疫苗混合后聯(lián)合免疫的安全性和免疫效果與單苗免疫相當，無干擾現(xiàn)象，可減少雞群應激，節(jié)省人工。本試驗結果也表明新支流三聯(lián)與重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗接種對雞免疫學功能無影響。

5 結 論

不同疫苗免疫對雞免疫功能的影響試驗結果顯示，試驗雞同時接種雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗和重組禽流感病毒H5 亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6 株+Re-8株）疫苗所產(chǎn)生的抗體效價與單獨接種重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（細胞源，Re-6株+Re-8株）的抗體水平相當，兩者無明顯差異。說明上述兩種不同疫苗對雞免疫學功能未產(chǎn)生影響。