郝瑞林 ，單樹花 ，胡曉燕 ，張志怡 ，李榮山 ，李卓玉

（1.山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006；2.忻州師范學院 生物系，山西 忻州 034000；3.山西省人民醫(yī)院，山西 太原 030006）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）屬于多孔菌屬，是一種罕見的白腐真菌，主要寄生在樺樹上[1-2]。樺褐孔菌主要分布在北緯45°～50°的寒冷地區(qū)，如中國的東北部以及北美和北歐的森林帶[3]。從樺褐孔菌中發(fā)現(xiàn)了豐富的次級代謝產(chǎn)物如多糖、萜類化合物、多酚以及黑色素[4-7]。樺褐孔菌的代謝產(chǎn)物顯示出優(yōu)異的預防腫瘤、改善炎癥反應、調(diào)節(jié)血糖代謝、免疫和改善氧化應激壓力的能力[8-13]，作為主要代謝物，樺褐孔菌來源的多酚顯示出多種生物學活性[14-16]。從樺褐孔菌中提取的3，4-二羥基苯甲醛肟（3，4-Dihydroxybenzaldoxime）對白血病和癌癥細胞具有強烈的細胞毒性作用[17]。兒茶酚丙烷類化合物可以通過阻斷拓撲異構酶II，抑制癌細胞的生長[18]。此外，酚類化合物可以顯著降低IL-6和TNFα，進而改善炎癥[19]。樺褐孔菌含有多種酚類化合物，可作為強效抗氧化劑[20]。樺褐孔菌的多酚提取物可防止過氧化氫誘導的氧化應激，而多糖、三萜和類固醇提取物無此作用[21]。目前，已從樺褐孔菌中鑒定出多種酚類化合物，包括在IO中鑒定出許多多酚，包括咖啡酸、3，4-二羥基二苯甲酮、沒食子酸、丁香酸、原兒茶醛、3，4-二羥苯甲醛、2，5-二羥基對苯二甲酸、Phelligridin C-I和 methylinoscavin A-B[18,22-23]。在這些酚類化合物中，Phelligridin D、Phelligridin E 和Phelligridin G顯示出較強的改善氧化應激壓力的能力[23]。

活性氧（ROS）在O2還原過程中產(chǎn)生，包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（OH·）[24-25]。ROS可導致細胞中大分子的氧化損傷，并導致細胞功能障礙[24]。過氧化氫酶是已知的ROS防御酶家族之一，能夠催化H2O2的分解，進而緩解由H2O2過量累積導致的氧化損傷[24,26-27]。糖尿病、骨肉瘤、結直腸癌以及膀胱癌等病理導致的過氧化氫酶活性降低是細胞中過氧化氫累積以及氧化應激壓力升高的主要原因[28-31]。CAT可以將代謝過程以及歧化反應所產(chǎn)生的副產(chǎn)品過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾退?，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免于過氧化氫的損害[32]。樺褐孔菌醇提取物和水提取物可以有效提高CAT的活性，進而改善氧化應激所誘發(fā)的炎癥反應[33-34]。酚類化合物是樺褐孔菌重要的組成成分，通過酚類化合物激活過氧化氫酶可能是樺褐孔菌緩解氧化應激壓力并改善相關疾病的重要途徑。

本研究應用鉬酸銨顯色法評估了樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶的調(diào)節(jié)作用，利用分子動力學模擬進一步分析了其具體機制，旨在闡明小分子化合物調(diào)控過氧化氫酶活性的可能機制，為抗氧化酶調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試樺褐孔菌子實體，從吉林省延邊朝鮮族自治州敦化市農(nóng)貿(mào)市場購買，子實體經(jīng)60 ℃烘干至恒質(zhì)量備用。

1.2 試劑、儀器與設備

色譜純甲醇和乙腈（賽默飛世爾科技股份有限公司（馬薩諸塞州，美國））；來源于牛肝的過氧化氫酶，由碧云天生物技術研究所（上海，中國）提供；過氧化氫酶活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

LC-16P制備型高效液相色譜儀（日本，島津）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本，島津）；LC-MS8050三重四級桿高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本，島津）；Synergy HTX全波長酶標儀（美國，安捷倫）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樺褐孔菌多酚的提取與分離純化 樺褐孔菌粉碎后過0.25 mm篩，提取和純化過程參考文獻[35]進行。純化后的樺褐孔菌酚類化合物通過高效液相色譜法（HPLC）進一步分離，并使用反相C-18制備柱（10 mm×250 mm，10 μm）。使用20% CH3CN（5%甲酸）作為洗脫劑，以流速10 mL/min洗脫90 min后得到12個餾分。通過HPLC-DAD-MS/MS對餾分進行表征[36]，餾分在60 ℃減壓濃縮后經(jīng)過冷凍干燥，將冷凍干燥后的樣品溶于蒸餾水后過0.22 μm濾膜。過濾后的樣品注入LC-MS8050高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，通過反相柱Poroshell 120 SB-C18（150 mm×4.60 mm，3.5 μm）分離和鑒定。分離采用0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B）作為流動相，洗脫梯度為0～5 min，5% B；5～45 min，5%～45% B；45～47 min，45%～5% B；47～50 min，5% B。流速為1.0 mL/min，進樣體積為20 μL。電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜法用于鑒定陽離子和陰離子模式下的酚類化合物。質(zhì)譜條件為電壓3.5 kV，干燥氣體為氮氣加熱至250 ℃，毛細管溫度為300 ℃，采集范圍為100～1 000 m/z。

1.3.2 過氧化氫酶活性檢測 過氧化氫酶分解H2O2的反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡合物，在405 nm 處測定其變化量，可計算出過氧化氫酶的活力。牛肝過氧化氫酶溶于50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH值7.0），得到過氧化氫酶儲備液（4.0×10-9mol/L）。制備濃度為1 mmol/L的樺褐孔菌酚類化合物的儲備溶液，并將其添加到過氧化氫酶儲備溶液中，混合液與反應緩沖液混勻后在37 ℃下孵育5 min。根據(jù)過氧化氫酶活性檢測試劑盒說明書，繼續(xù)操作并利用全波長酶標儀，在405 nm處測定吸光值（A）。

其中，A化合物+過氧化氫酶表示化合物與過氧化氫酶混合后反應液的吸光值，A化合物表示只含有樺褐孔菌酚類化合物的反應液的吸光值，A空白表示用蒸餾水等體積代替過氧化氫酶和酚類化合物的反應液的吸光值。

1.3.3 分子對接 使用AutoDock Vina軟件進行的計算對接研究樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶的影響[37]。從蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）中獲得過氧化氫酶（PDB ID：1TGU）的PDB格式文件。在對接模擬之前，使用UCSF Chimera程序?qū)⒌鞍踪|(zhì)的能量最小化[38]，用PyMOL軟件去除蛋白質(zhì)結構中的雜原子、水分子和重復鏈[39]。使用Autodock工具完成蛋白質(zhì)的脫氫、Gasteiger電荷的計算和非極性氫原子的融合[40]。處理后的蛋白質(zhì)結構文件保存為pdbqt格式。為了確保過氧化氫酶的活性位點在對接過程中被完全覆蓋并且配體可以自由移動，建立了尺寸為60 ?×60 ?×60 ?的網(wǎng)格盒，對接中心的X、Y、Z軸坐標分別為15.781、17.888和13.220。最大對接次數(shù)設置為50次。對接結果用PyMOL可視化和分析。

1.3.4 分子動力學模擬 為了收集更詳細的結合信息，使用GROMACS 2020.4對Phelligridin E與過氧化氫酶的對接結果進行了分子動力學模擬（MD）。使用acpype程序，GAFF力場用于預處理Phelligridin E。amber14ffSB力場用于處理過氧化氫酶。acpype軟件用于創(chuàng)建配體拓撲文件。設置大小為1 nm的盒子，通過添加Na+，使Phelligridin E/過氧化氫酶復合物的表面電荷降低到0后進行時間為50 ns的分子動力學模擬（MD）。使用VMD對模擬過程中Phelligridin E/過氧化氫酶復合物的軌道和結構進行均方根偏差（RMSD）、溶劑可及表面積（SAS）、氫鍵分析和結合自由能分解。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)結果均以平均值±標準偏差表示，統(tǒng)計分析用Excel和SPSS 26.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌酚類化合物的鑒定

應用HPLC-DAD-MS分析用于鑒定餾分1～12，結果如表1所示。

表1 HPLC-DAD-MS法鑒定樺褐孔菌中的酚類化合物Tab.1 Identification of phenolic compounds from Inonotus obliquus by HPLC-DAD-MS

由表1可知，餾分1～12被鑒定為原兒茶醛、丁香酸、8-去甲基桉樹素、2，5-二羥基對苯二甲酸、柚皮素、3-羥基-2-氧代苯-4，6-二羧酸、兒茶素、（E）-3，4-二羥基苯亞甲基丙酮、Phelligridin E、Methylinoscavin B、Interfungin B和Phelligridin I。

2.2 樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶是生物體抵抗氧化應激的重要屏障，在許多氧化應激相關的疾病中都出現(xiàn)了過氧化氫酶活性降低的現(xiàn)象[41]。通過激活過氧化氫酶等抗氧化酶的活性從而改善氧化應激導致的相關疾病是一種有效的策略。為了進一步探索樺褐孔菌酚類化合物應用于干預氧化應激相關疾病的可能性，本研究利用體外試驗分析了樺褐孔菌酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響，結果顯示（圖1），12種樺褐孔菌酚類化合物中僅有原兒茶醛、Phelligridin E 和 Phelligridin I顯示出增強過氧化氫酶活性的潛能，特別是Phelligridin E。經(jīng)終濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol/L的Phelligridin E處理后，過氧化氫酶的活性分別增加了41.90%、44.68%、52.66%、58.10%、62.78%和68.10%。

圖1 樺褐孔菌中的酚類化合物對過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effect of phenolic compounds from Inonotus obliquus on catalase′s activity

2.3 樺褐孔菌酚類化合物與過氧化氫酶的對接能量

為了分析樺褐孔菌酚類化合物激活過氧化氫酶的可能機制，應用分子對接技術比較了12個餾分與過氧化氫酶的結合自由能。由表2可知，在12種酚類化合物中，苯乙烯基吡喃酮類多酚與過氧化氫酶的結合能低于其他多酚，特別是Phelligridin E。提示Phelligridin E可能通過與過氧化氫酶的結合來增強酶的活性。

表2 過氧化氫酶與樺褐孔菌酚類化合物的結合自由能Tab.2 The binding energy between catalase and phenolic compounds from Inonotus obliquus kcal/mol

2.4 分子動力學模擬

2.4.1 分子動力學模擬穩(wěn)定性評價 通過檢查過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復合物在動力學模擬過程中的勢能、溫度、壓力和密度的變化來評價分子動力學模擬的質(zhì)量。如圖2所示，在模擬過程中，過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復合物的體系勢能和密度保持了穩(wěn)定，而體系溫度和壓力分別保持在300 K和 0 Pa，表明對過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復合物的模擬是高質(zhì)量的。

圖2 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E的分子動力學模擬（MD）評估Fig.2 Evaluation of MD（molecular dynamics） simulations of catalase and catalase/Phelligridin E

2.4.2 RMSD、RMSF、SAS和Rg分析 對比分析過氧化氫酶以及過氧化氫酶/Phelligridin E復合物在分子動力學模擬過程中的RMSD、RMSF、Rg和SAS，結果如圖3所示。從圖3可以看出，在模擬過程中，結合Phelligridin E后，過氧化氫酶的RMSD出現(xiàn)明顯波動；在模擬結束時，RMSD穩(wěn)定保持在0.6 nm。在與Phelligridin E結合的過程中，過氧化氫酶的0—100、400—450位的氨基酸殘基出現(xiàn)了較大的RMSF值變化。這些位置的氨基酸殘基可能參與了過氧化氫酶與Phelligridin E的結合及配體結合后引起的蛋白質(zhì)結構的變化過程。與Phelligridin E結合后，過氧化氫酶的Rg輕微增大；ROG常用于表征蛋白質(zhì)空間結構的緊湊程度，ROG分析結果表明，Phelligridin E可能使過氧化氫酶的空間結構變得松散。與Phelligridin E結合后，過氧化氫酶的SAS呈現(xiàn)出下降趨勢，表明Phelligridin E的結合可能使過氧化氫酶的親水性下降。

圖3 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復合物的50 ns分子動力學模擬結果Fig.3 Results of 50 ns molecular dynamics simulations of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.4.3 Phelligeidin E與過氧化氫酶相互作用分析 由圖4可知，在結合Phelligridin E之后，過氧化氫酶的20—50位以及360—400位的氨基酸殘基的空間構象發(fā)生明顯變化（白色箭頭表明結合Phelligridin E前后氨基酸殘基的構象有明顯變化）。這一改變與過氧化氫酶的RMSF的波動是一致的，過氧化氫酶空間結構的變化是由于酶與Phelligridin E之間的相互作用導致的。圖4-B、C展示了Phelligridin E相對于過氧化氫酶的空間分布，圖4-D、E展示了應用Protein_Ligand Interaction Profiler和LigPlot分析MD模擬第50 ns時的過氧化氫酶與Phelligridin E之間的相互作用。Protein_Ligand Interaction Profiler能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和配體做全面分析，包括氫鍵、疏水作用力和離子鍵分析[41]，而LigPlot能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和配體之間形成氫鍵的可能做更充分的評估[42]。Protein_Ligand Interaction Profiler分析結果顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶的ASN369、HIS372、ILE373形成較強的疏水作用力（圖4-D）。LigPlot分析結果顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶的ASP25、ASN369、HIS372、PRO391和CYS393形成氫鍵（圖4-E）。圖4-F顯示了MD模擬過程中Phelligridin E與過氧化氫酶間氫鍵的動態(tài)變化，在50 ns內(nèi)，過氧化氫酶與Phelligridin E間的氫鍵數(shù)量在2～6個。本研究利用gmx_MMPBSA對過氧化氫酶模擬過程中的吉布斯自由能進行了分解，結果顯示，過氧化氫酶的GLU67、ILE373、PRO391、PHE326和MET392對Phelligridin E與過氧化氫酶的結合貢獻較大（圖4-G）。其中，ILE373與Phelligridin E形成距離為3.63 ?的疏水作用力，PRO391與Phelligridin E形成距離為2.54 ?的氫鍵，但過氧化氫酶的GLU67未與Phelligridin E形成4 ?范圍內(nèi)的作用力。GLU67在空間上位于ASP25附近，ASP25與Phelligridin E之間的氫鍵可能導致GLU67的位置發(fā)生改變。以上分析表明，氫鍵和疏水作用力在促進Phelligridin E與過氧化氫酶的結合中可能同樣重要。

2.4.4 二級結構的變化 通過對MD模擬前后蛋白質(zhì)二級結構組成的對比分析，發(fā)現(xiàn)在結合Phelligridin E后，過氧化氫酶的二級結構組成發(fā)生明顯改變。如圖5顯示，Phelligridin E與過氧化氫酶之間的相互作用會導致酶分子的33—43、44—53、393—403、433—438位的氨基酸殘基所形成的二級結構發(fā)生改變。這些變化具體為40—43位以及50—53位氨基酸殘基傾向構建B-Sheet，393—400位氨基酸殘基傾向構建5-Helix，433—437位氨基酸殘基傾向構建3-Helix。

圖5 由過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復合物的所有氨基酸殘基形成的二級結構Fig.5 Secondary structure formed by all amino acid residues of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.4.5 過氧化氫酶的氨基酸殘基的二面角的變化 Phelligridin E 與過氧化氫酶間的相互作用力促進酶分子的VAL41、CYS393、ASP396、GLY399、GLY400發(fā)生二面角扭轉(zhuǎn)（圖6），二面角扭轉(zhuǎn)具體為ASN33-GLN53傾向形成B-Sheet，CYS393-ASN403形成5-Helix，ASN433-ASP438形成3-Helix。

圖6 過氧化氫酶和過氧化氫酶/Phelligridin E復合物氨基酸殘基的拉氏構象Fig.6 Ramachandran plot of amino acid residues of catalase and catalase/Phelligridin E complex

2.5 Phelligridin E 激活過氧化氫酶的可能機制

圖7-A詳細顯示了H2O2進入過氧化氫酶活性位點的主要通道，H2O2進入過氧化氫酶的通道被不同的氨基酸組包圍，包括由ALA333-ASN338形成的左側(cè)的隨機折疊片結構、由GLU71-GLY78形成的右側(cè)的雙螺旋結構、由TYR325-ILE332形成的上側(cè)的α-螺旋結構和由PRO151-PRO158形成的下側(cè)的無規(guī)則卷曲。為了分析Phelligridin E結合后過氧化氫酶活性位點的主要通道的大小，對模擬前后的通道的左右兩側(cè)和上下兩側(cè)之間的距離進行了分析。圖7-B結果顯示，結合Phelligridin E后，底物進入通道的左右兩側(cè)之間的距離無明顯變化，而上下兩側(cè)氨基酸基團之間的距離明顯增加。因此，推測由于上下氨基酸殘基之間的距離增加，底物進入活性位點的途徑增加，過氧化氫酶的活性也增加（圖7-C）。

圖7 Phelligridin E激活過氧化氫酶的機制Fig.7 Mechanism of Pheligridin E activating catalase

3 結論與討論

過氧化氫酶含有幾個到達深埋活性位點血紅素基團的通道。高度限制性的進入通道（稱為主通道）作為底物（H2O2）到達活性位點的首選途徑，并且只能通過該通道（主通道）進入活性位點血紅素基團。通道的大小與這4個組的移動有關，其大小決定了進入活性位點的襯底的量[43]。Phelligridin E與過氧化氫酶通過ASN369、HIS372、ILE373形成較強的疏水作用力，通過ASP25、ASN369、HIS372、PRO391和CYS393，形成氫鍵。Phelligridin E與過氧化氫酶之間的疏水作用力和氫鍵使過氧化氫酶的VAL41、CYS393、ASP396、GLY399、GLY400發(fā)生二面角扭轉(zhuǎn)，這種二面角扭轉(zhuǎn)推動ASN33-GLN53形成B-Sheet，CYS393-ASN403形成5-Helix，ASN433-ASP438形成3-Helix，其中，CYS393-ASN403形成的5-Helix和ASN433-ASP438形成的3-Helix,使活性中心上下兩側(cè)的氨基酸殘基之間的距離增加，使底物進入活性中心的入口增大，底物更容易進入包含血紅素輔基的活性中心，增強了過氧化氫酶消除過氧化氫的能力。