張梓杰,曾 琪,張 佟,雷海民,徐 冰

北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100102

中藥鱉甲(Carapaxtrionycis)為鱉科動(dòng)物鱉(Trio-nyxsinensisWiegmann)的背甲,具有滋陰潛陽、退熱除蒸和軟堅(jiān)散結(jié)的功效。以鱉甲為君藥的制劑鱉甲煎丸和復(fù)方鱉甲軟肝片在臨床上常用于治療肝纖維化[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明,鱉甲及其復(fù)方制劑具有防治肝細(xì)胞損傷、改善肝功能、減輕肝細(xì)胞變性壞死以及抑制肝纖維化形成的作用[3-4]。近年來的研究表明,小分子寡肽可能是鱉甲抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[5-7]。

本課題組在前期研究中從鱉甲中分離得到活性寡肽I-C-F-6(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1),其氨基酸序列為GAGPHGG。研究表明,I-C-F-6能通過降低肝臟中促炎、促纖維化因子白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,升高抗炎和抗纖維化因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)的水平,抑制肝組織中E-cadherin蛋白的表達(dá),顯著改善由CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[8-9]。賀松其教授團(tuán)隊(duì)采用CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維模型對(duì)I-C-F-6的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),其能顯著改善肝纖維化大鼠肝損傷,減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)沉積,抑制核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)p65和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化,進(jìn)而調(diào)控其下游CTGF、TGF-β1、TNF-α和VEGF等各種細(xì)胞因子的表達(dá)水平[10-11]。肽類化合物的現(xiàn)代合成方法分為固相合成法與液相合成法,其中固相合成法操作步驟簡單、易于投入實(shí)際生產(chǎn)[12]。因此,本實(shí)驗(yàn)用正交實(shí)驗(yàn),以目標(biāo)肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)選活性寡肽I-C-F-6的固相合成工藝,研究結(jié)果為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗肝纖維化創(chuàng)新藥物奠定基礎(chǔ)。

圖1 鱉甲寡肽I-C-F-6的結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀;Beta 2-8 LDplus型真空冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司);RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本EYELA有限公司);BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司);TY-80A/S型脫色搖床(常州榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

Fmoc-Gly-Wang resin、2-氯三苯甲基樹脂、Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(boc)-OH、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯[O-(6-chloro-1-hydrocibenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat,HCTU]、I-C-F-6(對(duì)照品)均購自吉爾生化(上海)有限公司;N,N’-二異丙基碳二亞胺(N,N’-diisopropylcarbodiimide,DIC,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)均購自上海麥克林生化科技有限公司;哌啶(piperidine,PIP,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole,HOBt,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDCI,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%]、N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)均購自北京伊諾凱科技有限公司;無水乙醚(分析純,北京市通廣精細(xì)化工公司三河分公司);甲醇(分析純)、二氯甲烷(分析純)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF,分析純)均購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、醋酸銨(色譜純)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑的配制

2.1.1體積分?jǐn)?shù)20% PIP-DMF溶液 取20 mL PIP,溶于80 mL DMF中,即得。

2.1.2體積分?jǐn)?shù)95%TFA溶液 量取5 mL去離子水加入95 mL TFA中,即得。

2.1.3Kaise test溶液 溶液1:取80 g苯酚溶于15.8 g無水乙醇中,即得;溶液2:取0.2 mL KCN(0.001 mol·L-1)溶于9.8 mL PIP中,即得;溶液3:取500 mg茚三酮溶于7.9 g無水乙醇中,即得。

3種溶液均需密閉避光保存。檢驗(yàn)時(shí)滴加溶液1、2、3各2～5滴,加熱4 min。

2.2 鱉甲七肽I-C-F-6的合成與檢測

2.2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。實(shí)驗(yàn)方法如下(以正交實(shí)驗(yàn)1為例)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平

(1)樹脂溶脹:稱取0.5 g Rink Amide MBHA樹脂,置于10 mL多肽反應(yīng)管中;加入7 mL DMF溶脹20 min,重復(fù)1次。

(2)投料:稱取Fmoc-Gly-OH 136.8 mg(氨基酸的投料量=樹脂的質(zhì)量×樹脂取代率×投料比×氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量),HCTU 192.4 mg,置于7 mL DMF中溶解,加入DIPEA 59.5 mg,于搖床上振搖1 h。

(3)Kaise test檢測:抽去反應(yīng)液,用DMF洗滌2次,取少許樹脂,滴入Kaise test溶液中,110 ℃加熱4 min,檢驗(yàn)溶液呈淡黃棕至紅棕色。

(4)Fmoc的脫除:量取7 mL 2.1.1項(xiàng)下制備的體積分?jǐn)?shù)為20%的PIP-DMF溶液,進(jìn)行Fmoc的脫除,并重復(fù)1次該操作,用DMF洗滌2次。

(5)Kaise test檢測:取少許樹脂,滴入Kaise test溶液,110 ℃加熱4 min,檢驗(yàn)溶液呈藍(lán)黑色(連接脯氨酸時(shí),溶液呈淡黃棕至紅棕色,樹脂為紅色)。

(6)重復(fù)步驟(2)—(5)。

(7)根據(jù)肽鏈倒置順序投料,制備目標(biāo)樹脂。

(8)樹脂的切割:用甲醇、二氯甲烷洗滌2次,抽干,加入切割液5 mL,置于搖床上振搖2 h。抽干切割液,減壓濃縮,倒入適量的冰乙醚內(nèi),以4 000 r·min-1離心3 min,棄去上清液,加入乙醚攪拌,再以4 000 r·min-1離心3 min,得沉淀,冷凍干燥。

正交實(shí)驗(yàn)2～9的操作步驟基本與正交實(shí)驗(yàn)1的相同,其中Fomc-Gly-Wang的投料順序?yàn)镚-H-P-G-A-G,且在樹脂溶脹后進(jìn)行Fmoc的脫除,Rink Amide MBHA樹脂溶脹后進(jìn)行保護(hù)基的脫除,其他步驟相同。

最終得到凍干粉樣品18份。

2.2.2鱉甲七肽I-C-F-6粗產(chǎn)物的檢測 色譜柱:月旭水性色譜柱Welch Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇為有機(jī)相A,以5 mmol·L-1醋酸銨水溶液作為水相B;梯度洗脫:98%B～27%A;檢測波長:220 nm;流速:1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

稱取粗產(chǎn)物凍干粉,配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的水溶液,每份樣品進(jìn)樣2次,以峰面積比計(jì)算相對(duì)含量,結(jié)果取平均值。結(jié)果見圖2(以實(shí)驗(yàn)8為例)。

注:A.I-C-F-6對(duì)照品;B.實(shí)驗(yàn)8粗產(chǎn)物。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

正交實(shí)驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,取平均值。用SAS 8.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析。L9(34)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果見表2。正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表2可見,各因素對(duì)鱉甲七肽I-C-F-6合成相對(duì)含量影響的順序?yàn)?A(樹脂類型)>D(反應(yīng)時(shí)間)>C(縮合劑的種類)>B(投料比)。由表3可見,樹脂的類型、投料比、反應(yīng)時(shí)間對(duì)I-C-F-6的合成均存在顯著性影響而縮合劑種類對(duì)I-C-F-6的合成不存在顯著性影響。因此,從生產(chǎn)實(shí)際和資源利用的角度考慮,可將合成的較優(yōu)工藝定為采用Fmoc-Gly-Wang樹脂,投料比(樹脂擔(dān)載量/氨基酸摩爾質(zhì)量)為1∶5,以6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯[O-(6-chloro-1-hydrocibenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat,HCTU]N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethy-lamine,DIPEA)為縮合劑,反應(yīng)2 h。

2.4 驗(yàn)證及放大實(shí)驗(yàn)

各實(shí)驗(yàn)平行1次,得到樣品6份,每個(gè)樣品進(jìn)樣2針,結(jié)果取平均值,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)肽產(chǎn)率為77.03%,在5倍和25倍放大實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)肽的產(chǎn)量分別為62.86%、78.69%。

3 討論

肽類化合物的固相合成涉及樹脂、縮合劑、氨基酸保護(hù)基的選擇,投料比與反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成的影響也十分顯著。在本實(shí)驗(yàn)中,選擇了以MBHA樹脂為代表的氨基樹脂、以WANG樹脂為代表的羥基樹脂、以2-氯三苯甲基樹脂為代表的三苯甲基樹脂作為樹脂類型的考察因素,選擇以DIC、EDCI為代表的碳二亞胺型縮合劑以及以HCTU為代表的鎓鹽型縮合劑作為縮合劑類型的考察因素,以確定活性多肽I-C-F-6的合成工藝。由于Fmoc保護(hù)基具有對(duì)酸敏感而對(duì)堿(脫保護(hù)溶液)不敏感的特性[13],故被應(yīng)用到本次實(shí)驗(yàn)中。投料比與反應(yīng)時(shí)間的選擇也基于高倍量反應(yīng)物推動(dòng)反應(yīng)正向進(jìn)行的原則加以確定[14]。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)1、3、4、5中I-C-F-6的產(chǎn)率相對(duì)較低,分析可能由于多肽固相合成中反應(yīng)投料比高倍量可促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行,而實(shí)驗(yàn)1和4的投料比過小且反應(yīng)時(shí)間短,導(dǎo)致反應(yīng)不完全,從而造成產(chǎn)率相對(duì)較低;而實(shí)驗(yàn)5雖然投料比為1∶3,但由于反應(yīng)時(shí)間不充足,導(dǎo)致產(chǎn)率較低;實(shí)驗(yàn)3采用DIC/HOBt作為縮合劑且以5倍投料反應(yīng),在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)有部分反應(yīng)原料析出,這可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)3產(chǎn)率低的原因。

中醫(yī)藥是世界醫(yī)學(xué)的寶藏,從中藥中尋找抗肝纖維化活性成分的報(bào)道很多[15-17],其中天然活性寡肽類成分具有良好的成藥性,可被人體腸道直接吸收[18],其與游離氨基酸相比,更容易進(jìn)入血液,目前尋找小分子活性寡肽作為藥物或先導(dǎo)化合物已成為國內(nèi)外藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[19]。中藥是優(yōu)質(zhì)的天然寡肽庫,對(duì)中藥中寡肽類活性成分的研究已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者的密切關(guān)注[20-21]。本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn),采用經(jīng)典的固相合成法,優(yōu)選鱉甲中抗肝纖維化活性寡肽I-C-F-6的合成工藝,操作簡單,適用于工業(yè)生產(chǎn),為I-C-F-6新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。