張建豐,梁 琦,李剛剛,延保國*

1. 西安市第八醫(yī)院藥劑科,西安 710061; 2. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安 710069

創(chuàng)新藥物研發(fā)是當(dāng)前國際科技競爭的戰(zhàn)略制高點之一,往往耗資巨大、耗時長久。在創(chuàng)新藥物研發(fā)進(jìn)程中,先導(dǎo)化合物的成藥性評價對于降低藥物研發(fā)風(fēng)險、提升研發(fā)成功率具有重大意義。目前,先導(dǎo)化合物的成藥性評價方法主要包括體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄以及毒性評價等,存在消耗時間長、樣品需求大量等不足,尤其是該評價過程無法證明化合物的作用靶點及作用方式,因此,亟需開發(fā)一種準(zhǔn)確、快速、易于操作的先導(dǎo)化合物的成藥性評價方法。

親和色譜[1-3]具有高通量和高重復(fù)性的特點,目前已經(jīng)成功應(yīng)用于藥物-受體相互作用的分析,該方法的應(yīng)用首先需要合成受體色譜固定相,WAINER I W等已經(jīng)成功實現(xiàn)了多種G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coulped receptor, GPCR)色譜固定相的制備,包括β2腎上腺素受體(β2-adrenoceptor,β2-AR)[4]、煙堿型受體[5]、阿片樣受體[6]、嘌呤受體[7]及大麻素受體[8]等,但以上受體色譜固定相均用物理吸附法制備,無法耐受色譜分析過程中流動相的持續(xù)洗脫,因此其穩(wěn)定性較差。

為了解決上述問題,將鹵代烷烴脫鹵素酶標(biāo)簽(halo-genated alkane dehalogenase tagged, Halo-tagged)融合至受體的非活性末端,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得Halo標(biāo)記的GPCR可通過生物正交反應(yīng)一步固定至大孔微球表面[9]。用該方法制備的受體色譜固定相具有與初始受體相當(dāng)?shù)幕钚?可用于藥物-受體相互作用分析和中藥靶向活性成分篩選。在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[10],本課題組用該方法制備了β2-AR色譜固定相并將其應(yīng)用于止嗽口服液活性成分的篩選,獲得了能夠靶向作用于β2-AR的甘草次酸,經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾,得到了先導(dǎo)化合物XC267,本研究用非線性色譜法,以固定化β2-AR為工具,對XC267進(jìn)行了初步成藥性評價,以期推動β2-AR靶向藥物的開發(fā)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

3100高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);UPD-II-10T超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司);ZHJH-1115B超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司);98-1-N電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);SS-326高壓滅菌鍋(TOMY公司);103恒溫培養(yǎng)箱(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司);5804R冷凍離心機(jī)(美國FEI公司);ZZXT-A裝柱機(jī)(大連依利特分析儀器有限公司);DYCZ-24DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司);JY92-2超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

氨基微球(知益微球有限公司);氯化鈉、酵母提取物、蛋白胨和瓊脂,均購自英國Oxoid公司;β2-AR一抗購自北京索萊寶生物科技有限公司;六水琥珀酸鈉、乳糖、甘油、二水檸檬酸鈉、葡萄糖、六水氯化鐵、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂和氯化銨,均購自天津市恒心化學(xué)試劑制造有限公司;甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅,均購自上海阿拉丁股份有限公司;色譜級甲醇購自美國Thermo Fisher公司;其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 β2-AR受體色譜固定相的制備

按照文獻(xiàn)中的方法[9],首先在大腸桿菌中表達(dá)了E.coliBL21(DE3)T7/halo-tagβ2-AR質(zhì)粒(pReceiver-B02)。該菌種自瓊脂糖培養(yǎng)基、一級液體培養(yǎng)基孵育后,37 ℃下在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h,離心使菌體沉淀,向1 g大腸桿菌細(xì)胞中加入10 mL濃度為20 mmol·L-1的PBS緩沖液,超聲破碎,收集上清,用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)確認(rèn)受體表達(dá)。將6-氯己酸通過?；磻?yīng)修飾至微球表面,通過Halo標(biāo)簽與微球表面氯離子的生物正交反應(yīng),將Halo標(biāo)記的β2-AR一步固定至微球表面,獲得β2-AR色譜固定相。經(jīng)濕法裝柱,即得β2-AR色譜柱,見圖1。

注:1.自誘導(dǎo)培養(yǎng)基菌體細(xì)胞;2.LB培養(yǎng)基菌體細(xì)胞;3.細(xì)胞裂解液上清;4.細(xì)胞裂解液沉淀。

2.2 色譜實驗

本研究的色譜實驗均在高效液相色譜儀進(jìn)行。流動相為磷酸鹽(20 mmol·L-1, pH 7.4)緩沖液。檢測波長:甲氧那明230 nm,沙丁胺醇276 nm,妥布特羅220 nm,XC267 254 nm。進(jìn)樣濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0,2.0 mmol·L-1;進(jìn)樣量為5 μL;進(jìn)樣溫度為25 ℃。

2.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗用Peakfit 4.12軟件中的非線性功能處理所得數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 β2-AR色譜固定相的制備及表征

用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)Halo標(biāo)記的β2-AR的表達(dá),超聲裂解細(xì)胞后,通過離心將混合物分為上清和沉淀,用Western blotting驗證目標(biāo)受體的表達(dá)情況,見圖1。如圖1所示,經(jīng)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基孵育,β2-AR的表達(dá)量顯著提高,進(jìn)一步分析可知,成功表達(dá)的受體主要存在于上清中,表明Halo標(biāo)記的β2-AR溶解性良好。

通過觀察甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特羅的甲醇溶液在β2-AR色譜柱上的保留行為考察該色譜系統(tǒng)的特異性,按照2.2項下條件進(jìn)樣檢測,見圖2。由圖2可知,甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特羅在β2-AR色譜柱上的保留時間分別為4.5 、4.9 、7.1 min,遠(yuǎn)長于該色譜系統(tǒng)的死時間,且各藥物保留時間差異較大,表明固定化β2-AR色譜柱可以通過保留時間的差異來識別其配體,具有特異性。

注:黑線.甲氧那明;藍(lán)線.沙丁胺醇;紅線.妥布特羅。

3.2 3種藥物與固定化β2-AR的相互作用分析

非線性色譜法是一種非理想條件下的色譜系統(tǒng)方程,適用于親和色譜結(jié)合速率常數(shù)的測定,該理論是基于以下2個假設(shè):(1)假設(shè)色散和柱外效應(yīng)可忽略,(2)假設(shè)吸附和解離的動力學(xué)速率是色譜峰展寬的主要原因。其方程如下[11]。

(1)

(2)

y表示歸一化的信號強(qiáng)度,x是調(diào)整保留時間,I0( )和I1( )是調(diào)整貝爾塞函數(shù),a0為峰面積參數(shù),a1為動力學(xué)容量因子參數(shù),a2為峰展寬參數(shù),a3為峰變形參數(shù)。根據(jù)該方程可求得配體與受體的解離速率常數(shù)Kd以及平衡常數(shù)KA,計算公式為Kd=1/(a3t0);KA=a3/C0。

由上述方程可知,非線性色譜法不僅能準(zhǔn)確測定結(jié)合常數(shù),而且能同步獲得受體與配體的解離速率參數(shù),為受體-藥物相互作用參數(shù)的全面測定提供了借鑒。此外,與前沿分析法、競爭置換法等方法相比,該方法無需用大量配體飽和色譜柱,有效彌補(bǔ)了分析時間長和藥物用量大的不足。

將上述3種配體在不同濃度下的色譜參數(shù)導(dǎo)出為excel文件,其中,X為保留時間,Y為紫外吸收強(qiáng)度,t0為死時間,C0為進(jìn)樣脈沖寬度與溶質(zhì)的濃度的乘積,其中進(jìn)樣脈沖寬度為定量環(huán)體積與色譜系統(tǒng)死體積的比值,按照x=X/t0,y=Y/C0進(jìn)行歸一化處理即得上述方程中的x和y。將x和y導(dǎo)入Peak fit4.11,用最小二乘法對所得色譜峰進(jìn)行去基線處理,對色譜峰進(jìn)行擬合,可得到非線性有關(guān)參數(shù),見圖3。

圖3 沙丁胺醇在β2-AR色譜柱上的非線性色譜擬合圖

用非線性色譜法進(jìn)行藥物-受體相互作用分析,在色譜柱不飽和時,a1和a2并不隨著進(jìn)樣濃度的改變而改變。3種藥物在6種進(jìn)樣濃度下的參數(shù)見表1。由表1可知,3種藥物對應(yīng)的濃度范圍為甲氧那明0.05～0.20 mmol·L-1,沙丁胺醇0.10～0.50 mmol·L-1,妥布特羅0.10～0.20 mmol·L-1,通過3種配體對應(yīng)的濃度范圍內(nèi)a2和a3,即可求得3種藥物與β2-AR的結(jié)合常數(shù)和解離速率常數(shù),見表2。甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅與β2-AR的結(jié)合常數(shù)分別為4.9×103、9.9×103、2.0×104L·mol-1。與文獻(xiàn)報道的結(jié)合常數(shù)相比,雖然3種藥物的結(jié)合常數(shù)低一個數(shù)量級,這可能是由于受體的來源不同導(dǎo)致的,但3種藥物的結(jié)合常數(shù)的大小排序與文獻(xiàn)報道一致[12],妥布特羅與β2-AR的結(jié)合常數(shù)最大,表明妥布特羅與受體的結(jié)合力最強(qiáng)。同時,甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅與β2-AR的解離速率常數(shù)為8.1、13.8、5.7 s-1,其中,甲氧那明與妥布特羅具有相當(dāng)?shù)慕怆x速率常數(shù),表明這2種藥物與受體結(jié)合后解離速度更慢,作用更久,與文獻(xiàn)報道一致[13]。以上結(jié)果證明固定化β2-AR可用于藥物-受體相互作用的分析。

表1 非線性色譜法測定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅在不同濃度下的參數(shù)

表2 非線性法測定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅與β2-AR的相互作用參數(shù)

3.3 先導(dǎo)化合物與固定化β2-AR的相互作用分析

前期研究發(fā)現(xiàn)了具有潛在抗哮喘作用的甘草次酸衍生物XC267,結(jié)構(gòu)式見圖4,用本文所建立的固定化β2-AR模型評價該化合物的成藥性,結(jié)果與陽性藥一致,分別按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol·L-1的濃度將XC267進(jìn)樣到β2-AR色譜柱,按照公式(1)處理后,XC267的非線性色譜參數(shù)見表3,計算得XC267與β2-AR的結(jié)合常數(shù)為4.4×103L·mol-1,解離速率常數(shù)為8.7 s-1,雖然遠(yuǎn)小于妥布特羅,但該化合物與甲氧那明具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合常數(shù)與解離速率常數(shù),表明該化合物能特異性作用于β2-AR,成藥性良好。

表3 非線性色譜法測定XC267在不同濃度下的參數(shù)

圖4 化合物XC267的結(jié)構(gòu)

4 結(jié)論

通過生物正交法將β2-AR一步固定至大孔微球表面,成功制備固定化β2-AR色譜模型,用非線性色譜法測定了甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特羅作用于β2-AR的結(jié)合常數(shù)和解離速率常數(shù),證明該色譜模型可用于先導(dǎo)化合物的篩選和評價。進(jìn)一步用該模型對XC267的成藥性進(jìn)行評價,證實XC267具有與甲氧那明相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合常數(shù)和解離速率常數(shù),是一種潛在的β2-AR特異性激動劑。本研究亦為先導(dǎo)化合物的成藥性評價提供了方法學(xué)借鑒。