李 立,羅 軼*,李麗莉*,蔣 湘,黃燕紅

1．廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所,國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室,南寧 530021;2．廣西-東盟食品檢驗檢測中心,南寧 530021

白背三七Gynuradivaricata(L.) DC.為菊科三七草屬植物白子菜的全草,又名金雞毛草、白子菜、雞毛菜等,具有清熱、活血、止血的功效,主治咳嗽、瘡瘍、燙火傷、跌打損傷、風濕痛、崩漏及外傷出血[1]。白背三七是廣西常見的壯瑤藥之一,可用于各種炎癥的治療,民間廣泛應用于高血脂癥、胃病、糖尿病和高血壓的治療[2]。近年來,學者從白背三七中分離得到了黃酮類、三萜類、甾醇類、核苷類、生物堿類等化學成分[3-6]。李麗梅等[7]用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術檢測出白背三七中含有全緣千里光堿。吡咯里西啶生物堿(pyrrolizidine alkaloids, PAs)及其氮氧化物(pyrrolizidine alkaloidN-oxides, PANOs)的分子結(jié)構(gòu)是1,2位具有雙鍵的雙稠吡咯啶環(huán),其不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)是PAs及PANOs產(chǎn)生毒性的前提,攝入過多或過久都會導致不可逆的肝損傷,嚴重者會出現(xiàn)肝硬化及肝纖維化[8-15]。2020年歐盟發(fā)布關于食品中PAs的含量規(guī)定,草藥的最高限量規(guī)定為200 μg·kg-1,該規(guī)定適用于草藥及所有食品原料,于2022年7月1日正式實施[16]。因此對中草藥的PAs及PANOs進行檢測具有重要意義。

目前已在菊科植物中檢測到倒千里光堿、千里光菲靈堿和千里光寧堿等PAs及PANOs[17-18]。白背三七是菊科植物,但未有文獻報道白背三七中含有PAs及PANOs。本文根據(jù)文獻報道菊科植物中存在的PAs及PANOs,用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)對白背三七中的芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物、春千里光堿、野百合堿、春千里光堿-N-氧化物、倒千里光堿、千里光菲靈堿和千里光寧堿進行篩查,其分子結(jié)構(gòu)見圖1,根據(jù)篩查結(jié)果初步對其進行風險評價。

注:1. 芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物;2. 春千里光堿;3. 春千里光堿-N-氧化物;4. 倒千里光堿;5. 千里光菲靈堿;6. 千里光寧堿;7. 野百合堿。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Exion LC超高效液相色譜-聯(lián)用TRIPLE QUAD 6500+三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX);XS205DU十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多有限公司);MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱(美國沃特斯有限公司)。

1.2 試藥

對照品:芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物(批號12642,質(zhì)量分數(shù)>98%)、春千里光堿(批號14139,質(zhì)量分數(shù)>98%)和春千里光堿-N-氧化物(批號14845,質(zhì)量分數(shù)>98%),均購自PhytoLab GmbH公司;倒千里光堿(批號PF190423-03,質(zhì)量分數(shù)>98%)、野百合堿(批號RF190526-08,質(zhì)量分數(shù)>98%)和千里光寧堿(批號PF190717-06,質(zhì)量分數(shù)>98%),均購自Stanford Chemicals公司;千里光菲靈堿(批號DST1908125,質(zhì)量分數(shù)>98%,成都德思特生物技術有限公司)。

白背三七樣品共5批(編號為S1～S5),分別采自廣西壯族自治區(qū)東興市、欽州市、北海市、防城港市及柳州市,經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所黃清泉主管中藥師鑒定為白背三七的全草。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱定野百合堿、芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物、春千里光堿、春千里光堿-N-氧化物、倒千里光堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿對照品適量,分別加甲醇配成質(zhì)量濃度為10.256、10.368、10.154、9.985、10.280、9.887、10.065 μg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液1.0 mL,置于同一20 mL量瓶中,加入體積分數(shù)為50%的甲醇稀釋至刻度,得到7種成分質(zhì)量濃度分別為0.512 8、0.518 4、0.507 7、0.499 2、0.514 0、0.494 4、0.503 2 μg·mL-1的混合對照品溶液,備用。

2.1.2供試品溶液 精密稱取白背三七粉末(過4號篩)2.0 g,置于具塞錐形瓶中,加入0.05 mol·L-1硫酸溶液20 mL,超聲(320 W,40 kHz)提取30 min,過濾,取續(xù)濾液10 mL,過SPE-MCX固相萃取小柱,先用甲醇10 mL淋洗, 再用體積分數(shù)為5%的氨水-甲醇溶液10 mL洗脫,最后收集洗脫液,濃縮至1 mL,用體積分數(shù)為50%的甲醇定容至20 mL,即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm);柱溫為40℃。流動相:A為1 mL·L-1甲酸與5.0 mmol·L-1甲酸銨水溶液,B為1 mL·L-1甲酸的甲醇,梯度洗脫:0～12 min,5%～30% B;12～13 min,30%～90% B;13～16 min,90% B;流速為0.3 mL·min-1。進樣量為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

用電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)離子源,正離子,質(zhì)譜多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式,氣簾氣(urtain gas,CUR)流速為20 L·min-1,噴霧電壓(ionspray voltage,IS)為5 500 V,離子源溫度(temperature,TEM)為450 ℃,質(zhì)譜條件見表1,對照品及供試品色譜圖見圖2、圖3。

表1 目標成分的質(zhì)譜參數(shù)

注:1.芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物;2.春千里光堿;3.春千里光堿-N-氧化物;4.倒千里光堿;5.千里光菲靈堿;6.千里光寧堿;7.野百合堿。

注:4. 倒千里光堿。

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系、檢測限(limited of detection,LOD)和定量限(limited of quantification,LOQ) 精密吸取混合對照品溶液0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL,置于10 mL量瓶中,加入體積分數(shù)為50%的甲醇定容至刻度,搖勻,得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,按照2.2項下色譜條件進行檢測。以對照品峰面積y作為縱坐標,以相應質(zhì)量濃度x作為橫坐標,進行線性回歸。以定量離子的色譜峰信噪比(S/N≥3)對應的最小質(zhì)量濃度為LOD,以定量離子色譜峰信噪比(S/N≥10)對應的最小質(zhì)量濃度為LOQ,結(jié)果見表2。

表2 7個化合物的線性方程、線性范圍、檢測限和定量限

2.4.2精密度 精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液2 μL,連續(xù)進樣6次并記錄峰面積。計算得各對照品峰面積的RSD值(n=6)為1.62%～2.54%,表明該儀器的精密度良好。

2.4.3重復性 取S1號供試品溶液6份,分別加5.0 mL混合對照品溶液,按照2.1.2項下方法制備,進樣測定。計算得各對照品含量的RSD值為2.25%～3.51%,表明該方法的重復性良好。

2.4.4穩(wěn)定性 取S1號供試品溶液,分別在0、4、8、12、24 h進樣檢測。計算得各對照品峰面積的RSD值(n=6)為1.30%～2.62%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5回收率 取S4號供試品6份,每份約1.0 g,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,精密加入2.1.1項下的混合對照溶液1.0 mL,按照2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照2.2項下色譜條件測定,計算回收率。計算得芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物、春千里光堿、春千里光堿-N-氧化物、倒千里光堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、野百合堿的平均加樣回收率分別為90.20%、88.62%、91.44%、89.75%、92.16%、90.89%、 89.31%,RSD值分別為2.02%、2.55%、3.12%、2.61%、2.76%、3.48%、2.98%。

2.5 含量測定

取不同產(chǎn)地白背三七2.0 g,精密稱定,按照2.1.2項下方法制備供試品溶液,按照2.2和2.3項下條件進樣檢測,用外標法計算芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物、春千里光堿、春千里光堿-N-氧化物、倒千里光堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿、野百合堿的含量,結(jié)果顯示5批樣品中均檢出倒千里光堿,其余成分尚未檢出。結(jié)果見表3。

表3 樣品的含量測定結(jié)果(其中 S1:n=6;S2～S5:n=2)

3 含量測定結(jié)果分析及風險評價

3.1 含量測定結(jié)果分析

5批白背三七中均檢出倒千里光堿,其含量為158.76～1 714.89 μg·kg-1。從產(chǎn)地分析,廣西柳州市的白背三七中倒千里光堿的含量最高,但由于批次較少,產(chǎn)地與吡咯里西啶含量之間存在的規(guī)律需要采集不同產(chǎn)地多批次藥材加以比較分析得出。

3.2 風險評價

該研究所測5批白背三七樣品中吡咯里西啶生物堿的含量為158.76～1 714.89 μg·kg-1,按照《中藥大辭典》[1]規(guī)定白背三七用量以6～15 g計,日攝入量為0.95～25.72 μg。目前我國無該藥材的PAs限值規(guī)定。歐洲藥品監(jiān)管局(EMA)于2016年針對含有吡咯里西啶生物堿的草藥污染問題發(fā)表公開聲明[19],草藥委員會建議每日PAs的攝入量在0.35 μg以下,5批白背三七中PAs的含量均遠遠超過歐盟的標準規(guī)定。

當前國際權威機構(gòu)在進行吡咯里西啶生物堿風險評價時,均以暴露限值(margin of exposure,MOE)為標準。如果MOE>10 000,則健康風險小;反之,則大。白背三七中PAs的MOE用公式(1)、公式(2)進行計算,結(jié)果見表4。

表4 白背三七中吡咯里西啶生物堿的風險評估結(jié)果

EDI=C×M/(BW×1 000)

(1)

MOE=BMDL10/EDI

(2)

式中,EDI為估計每日攝入量(μg·kg-1·d-1);C為藥材中含有PAs的總量(μg·kg-1);M為藥材的最大使用劑量,白背三七為15 g;BW為人體體質(zhì)量,以70 kg計;1 000為換算因子。BMDL10是PAs健康指導值,為237 μg·kg-1·d-1[20]。

5批白背三七的MOE均小于10 000,若長期使用,存在用藥風險。因此,藥材標準中有必要增加PAs的限量規(guī)定和服用風險提示,以降低用藥風險,確保用藥安全。

4 討論

4.1 色譜柱的選擇

本研究考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)3種不同型號的色譜柱對相同質(zhì)量濃度的對照品溶液進行分析,考察其分離效果與保留時間。用Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱時春千里光堿和千里光寧堿色譜峰無法分開,用Thermo Hypersil GOLD柱時色譜峰的峰形不夠尖銳,用Agilent Poroshell 120 SB-C18柱時分離效果最好,能使春千里光堿和千里光寧堿這對同分異構(gòu)體達到基線分離,且峰形更尖銳且對稱,響應值高,因此用Agilent Poroshell 120 SB-C18作為本研究的色譜柱。

4.2 流動相的選擇

本研究分別考察了甲醇-水,乙腈-水,1 mL·L-1甲酸-乙腈,1 mL·L-1甲酸乙腈-5.0 mmol·L-1甲酸銨,1 mL·L-1甲酸甲醇-5.0 mmol·L-1甲酸銨(含1 mL·L-1甲酸)等流動相對待測化合物的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 mL·L-1甲酸甲醇能使基線噪音較低,有效改善峰形,含1 mL·L-1甲酸和5.0 mmol·L-1甲酸銨的水溶液能提高化合物的響應值和離子化的效率。因此選擇1 mL·L-1甲酸甲醇作為有機相,1 mL·L-1甲酸和5.0 mmol·L-1甲酸銨的水溶液作為水相。

4.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1 μg·mL-1的混合對照品溶液在正、負離子模式下進行全掃描,7種化合物在正離子模式下均能得到很好的加氫峰,響應強度較好。優(yōu)化去簇電壓使母離子的相應豐度最大且穩(wěn)定,同時優(yōu)化碰撞能量,選擇響應豐度較高、出峰穩(wěn)定、無干擾的2～3個碎片離子作為子離子,其中響應最高的作為定量離子。

4.4 樣品前處理方法的選擇

4.4.1提取溶劑的選擇 PAs提取一般用極性較大的溶劑,如甲醇[21]或水[22]等,加入少量的酸,可以提高PAs的水溶性[23-24]。本研究考察了甲醇、甲醇-水、0.05 mol·L-1硫酸水等作為提取溶劑時的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不加酸提取,所有PAs用水提取的回收率均低于用甲醇提取的回收率;用0.05 mol·L-1硫酸水提取的回收率均高于用甲醇提取的回收率。因此確定提取溶劑為0.05 mol·L-1硫酸水?？赡苁且驗镻As為堿性化合物,在酸性環(huán)境中以離子形式存在,增強水溶性,導致酸水提取效率比甲醇高。

4.4.2固相萃取小柱的選擇 固相萃取、液-液萃取等方式可以減少背景干擾,提高結(jié)果的準確性。本實驗考察了C18-SPE、Waters Oasis HLB、聚合物陽離子小柱(HyperSep Retain-CX)、混合型弱陽離子固相萃取小柱(PCX)和混合型陽離子固相萃取小柱(MCX)5種類型的小柱,見圖4。由圖4可知,用C18-SPE和HyperSep Retain-CX小柱對7種成分進行凈化,效果不理想;野百合堿、千里光菲靈堿、春千里光堿-N-氧化物在用HLB小柱萃取時回收率均低于70%;PCX對千里光菲靈堿、千里光寧堿和春千里光堿的保留較差,回收率也低于70%;而MCX對7種成分具有較高的選擇性,回收率均大于80%,均獲得了很好的凈化效果。因此選擇MCX固相萃取小柱進行樣品的提取凈化。

圖4 7種吡咯里西啶生物堿過不同萃取小柱的回收率

4.4.3洗脫溶劑的優(yōu)化 因被測成分均為生物堿類成分,在堿性條件下容易被洗脫,因此選用氨化甲醇作為洗脫溶劑?？疾炝?%、5%、10% 3種不同體積分數(shù)的氨化甲醇和5、10、15 mL 3種不同體積氨化甲醇對被測成分的影響,綜合考慮被測成分的洗脫效果等因素,最后選擇10 mL 體積分數(shù)為5%的氨化甲醇作為洗脫溶劑,能達到最佳的洗脫效果。

5 小結(jié)

本研究建立的UPLC-MS/MS專屬性強,可在20 min內(nèi)快速分析芝麻菜葉千里光堿-N-氧化物、春千里光堿、春千里光堿-N-氧化物、倒千里光堿、千里光菲靈堿、千里光寧堿和野百合堿7個PAs及PANOs的含量。本研究結(jié)果顯示,5批白背三七中均含有倒千里光堿,風險評估結(jié)果顯示白背三七存在一定的用藥風險。民間常用白背三七治療胃病、高血壓、高血脂癥及糖尿病等,因此有必要建立白背三七中PAs的檢測方法并加強對白背三七中PAs含量的監(jiān)管。