李文楊魏歌劉秀青魏嵐岳建華

(信陽農(nóng)林學(xué)院林學(xué)院/信陽市林木遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南信陽 464000)

植物化感作用在農(nóng)業(yè)、旱生沙地、牧場(chǎng)和草原等農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，作為一門新興的交叉學(xué)科，目前已成為研究的熱點(diǎn)。 Moral等[1]研究指出，短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)對(duì)3種植物的化感作用效應(yīng)不同，表明植物間化感作用存在個(gè)體差異。 南方紅豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)全株含紫杉醇及其衍生物[2]，具有顯著的發(fā)展?jié)摿Α?李春英等[3]研究發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉枝和根浸提液對(duì)喜樹(Camptotheca acuminataDecne.)種子具有化感作用。

近年來，中藥材需求不斷增加。 受我國耕地資源、種植條件限制，加上藥用植物年齡增加和經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使而普遍出現(xiàn)的藥用植物連作和生長不良現(xiàn)象，導(dǎo)致藥材質(zhì)量和產(chǎn)量顯著下降，因此連作障礙已成為制約我國中藥生產(chǎn)發(fā)展的重大問題[4-5]。 林藥間作作為林地行間種植中藥材的栽培模式，可充分利用森林資源發(fā)展林下經(jīng)濟(jì)，是農(nóng)林復(fù)合經(jīng)營模式中的一種，具有高效可行性[6-7]。但目前林藥間作還處于探索研究階段，還需要通過試驗(yàn)來確定合理的不同林藥植物間作模式及其經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益表現(xiàn)。 關(guān)于南方紅豆杉與農(nóng)作物、草本植物、喬木之間的化感作用及其間套作也有待進(jìn)一步深入研究。 本試驗(yàn)以3 種藥用植物即黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)為受體，研究南方紅豆杉鮮葉浸提液對(duì)其種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用，旨在了解林藥植物之間的化感作用，探明南方紅豆杉與3 種藥用植物林藥間作的可行性，為南方紅豆杉間作套種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

浸提液供試材料選取:于2021年10月下旬在河南省信陽市信陽農(nóng)林學(xué)院南方紅豆杉大棚試驗(yàn)基地選擇5年生南方紅豆杉植株，采其帶有新鮮嫩綠葉片的枝條。

受體材料:黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、紫花苜蓿(Medicago sativaL.)、牛蒡(Arctium lappaL.)3 種藥用植物種子，2021年9月中下旬購于河北萬草種業(yè)有限公司。

1.2 南方紅豆杉浸提液的制備

將選取的南方紅豆杉枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，用流水沖洗葉片，再用蒸餾水沖洗若干次，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)晾干表面水分，之后將剪碎的葉片用粉碎機(jī)粉碎后備用。 稱量100 g 南方紅豆杉葉粉放入到1 000 mL 蒸餾水中浸泡48 h，之后用紗布過濾得到100 g·L-1純濃度母液，-4 ℃冷藏。 用蒸餾水將南方紅豆杉葉浸提液分別稀釋成2、6、10 g·L-1三種不同濃度。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

參照田勝尼等[7]和李怡瑩[8]的方法進(jìn)行。按種子質(zhì)量指標(biāo)分別選取黃芩、紫花苜蓿和牛蒡種子，均用1% KMnO4溶液消毒30 min，再用無菌水沖洗干凈，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。 不同處理培養(yǎng)皿分別加入2、6、10 g·L-1南方紅豆杉葉浸提液2 mL，對(duì)照(CK)加相同體積的蒸餾水。 每個(gè)培養(yǎng)皿放置種子40 粒，每處理重復(fù)3 次。 將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，溫度控制在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照14 h/黑暗10 h。 每天觀察種子發(fā)芽情況，3 天補(bǔ)充1 次相同濃度的浸提液。 黃芩和牛蒡種子在萌發(fā)第5 天、紫花苜蓿種子在第4 天計(jì)算初次發(fā)芽率，在萌發(fā)第10—14 天計(jì)算末次發(fā)芽率，統(tǒng)計(jì)各處理種子每天的發(fā)芽指數(shù)并計(jì)算平均值。

發(fā)芽率(GR)＝(正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)＝∑Gt/Dt，式中Gt 為第t 天種子發(fā)芽數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.4 幼苗生長試驗(yàn)

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，將已發(fā)芽種子從培養(yǎng)皿中移栽到帶浮漂板的水培育苗盤(育苗盤規(guī)格為:長32.5 cm、寬24.5 cm、高12 cm，用種植棉固定植株于外孔徑35 mm、內(nèi)徑23.5 mm 的定植籃后再放入孔徑為32 mm 的浮漂板上)中，用7 天營養(yǎng)液(史丹利水培型植物營養(yǎng)液:營養(yǎng)液∶水＝1∶200 mL)與7 天蒸餾水交替培養(yǎng)，蒸餾水與營養(yǎng)液中分別加入不同處理濃度浸提液，培養(yǎng)條件同1.3 步驟，30 天時(shí)采樣測(cè)定苗高、根長和生理生化指標(biāo)。

1.5 生理生化指標(biāo)測(cè)定

每個(gè)處理隨機(jī)選取12 株幼苗為試材，混合采樣后立即用液氮冷凍，-80 ℃下貯藏。 采用乙醇提取比色法[9]測(cè)定光合色素含量，采用硫代巴比妥酸法[10]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，采用WST-1法[11]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用可見分光光度法[12]測(cè)定過氧化物酶(POD)活性，采用紫外分光光度法[13]測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和差異顯著性檢驗(yàn)。 參照Williamson[14]、鄒子湘[15]等的方法，采用化感效應(yīng)指數(shù)(RI)進(jìn)行化感效應(yīng)分析，公式為:

式中，C 為CK 值，T 為處理值。

化感效應(yīng)的強(qiáng)弱＝｜RI ｜，與CK 相比，正值表示促進(jìn)(RI＞0)，負(fù)值表示抑制(RI＜0)，化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)是各項(xiàng)RI 的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物種子萌發(fā)的影響作用不同(表1)。 其中，2 g·L-1浸提液顯著抑制黃芩和牛蒡的發(fā)芽率，對(duì)紫花苜蓿的發(fā)芽率影響不顯著；10 g·L-1浸提液顯著降低紫花苜蓿的發(fā)芽率，對(duì)黃芩和牛蒡的發(fā)芽率影響不顯著。 10 g·L-1浸提液濃度下黃芩、紫花苜蓿和牛蒡的發(fā)芽指數(shù)最高，比CK 分別上升3.10%、0.93%和3.71%。

10 g·L-1南方紅豆杉浸提液顯著促進(jìn)黃芩、紫花苜蓿和牛蒡的幼苗生長，苗高比CK 分別增加26.15%、42.23%和109.02%(P＜0.05)，根長比CK 分別增加111.18%、39.53%和48.33%(P＜0.05)。 不同濃度浸提液對(duì)黃芩根長均呈顯著促進(jìn)趨勢(shì)，其中6 g·L-1浸提液促進(jìn)作用最低。 紫花苜蓿苗高和根長分別在2、6 g·L-1浸提液濃度下達(dá)到抑制最大值，與CK 相比，分別下降18.94%、32.05%(P＜0.05)。 對(duì)牛蒡苗高和根長的抑制作用均在2 g·L-1浸提液濃度下最大，且差異顯著。

2.2 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物光合色素含量的影響

由表2 可以看出，南方紅豆杉浸提液濃度為10 g·L-1時(shí)，黃芩的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量最高，呈促進(jìn)作用，與CK 相比分別增加26.09%、16.67%和25.00%，其中葉綠素a 和葉綠素總含量差異顯著。 在2 ～10 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量隨濃度增加而降低，表現(xiàn)為抑制作用；10 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿葉綠素a 和類胡蘿卜素含量比CK 分別下降51.72%和66.67%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液對(duì)紫花苜蓿葉綠素b 含量有促進(jìn)作用，比CK 增加8 倍(P＜0.05)。 南方紅豆杉浸提液對(duì)牛蒡的葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量具有“低濃度促進(jìn)高濃度抑制”的作用，6 g·L-1浸提液對(duì)牛蒡的光合色素含量促進(jìn)作用最強(qiáng)；10 g·L-1浸提液抑制作用最大，其葉綠素a、類胡蘿卜素含量和葉綠素總含量與CK 相比分別下降29.41%、50.00%和13.04%。

2.3 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物丙二醛(MDA)含量和保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響由圖1 可知，2 g·L-1浸提液處理黃芩和紫花苜蓿的MDA含量最高，比CK 分別增加19.43%和141.05%，且紫花苜蓿達(dá)到顯著水平；6 g·L-1浸提液處理黃芩和紫花苜蓿的MDA 含量最低，與CK 相比分別下降45.12%和10.14%。 6 g·L-1浸提液處理牛蒡的MDA 含量最高，與CK 相比增加87.71%(P＜0.05)；2 g·L-1濃度處理的MDA 含量最低，與CK相比下降15.20%。

圖1 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物丙二醛含量及保護(hù)酶活性的影響

2.3.2 對(duì)過氧化物酶(POD)活性的影響6 g·L-1浸提液處理牛蒡的POD 活性最高，與CK 相比升高164.00% (P＜0.05)。 各濃度處理間相比6 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿的POD 活性最高；2 g·L-1浸提液處理黃芩的POD 活性最高，而該濃度下紫花苜蓿的POD 活性最低，兩者比相應(yīng)CK分別下降34.67%和38.94%(P＜0.05)。 10 g·L-1浸提液處理牛蒡的POD 活性最低，但比CK 仍升高26.00%，達(dá)顯著水平(圖1)。

2.3.3 對(duì)過氧化氫酶(CAT)活性的影響10 g·L-1浸提液處理黃芩的CAT 活性最高，與CK 相比升高345.46%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液處理的CAT活性最低，與CK 相比也顯著升高227.26%。2 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿和牛蒡的CAT 活性最高，比相應(yīng)CK 分別升高163.64%、227.27%(P＜0.05)；10 g·L-1浸提液處理的CAT 活性最低，但較CK 也分別升高36.36%、63.64%(P＜0.05)。

2.3.4 對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響2 g·L-1浸提液處理黃芩的SOD 活性最低，比CK下降12.69%；10 g·L-1浸提液處理的SOD 活性最高，比CK 上升8.38%。 10 g·L-1浸提液處理紫花苜蓿的SOD 活性最低，與CK 相比降低23.54%(P＜0.05)；6 g·L-1浸提液處理的SOD 活性最高，與CK 相比差異不顯著。 10 g·L-1浸提液處理牛蒡的SOD 活性最低，比CK 下降37.59%(P＜0.05)；2 g·L-1浸提液處理牛蒡的SOD 活性最高，與CK 相比顯著上升11.21%。

2.4 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)的影響

由表3 可以看出，南方紅豆杉浸提液各濃度處理下黃芩發(fā)芽率的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)均為負(fù)值，呈抑制趨勢(shì)；根長的RI 均為正值，呈促進(jìn)趨勢(shì)；葉綠素總含量的RI 值說明，隨著浸提液濃度增加呈現(xiàn)低濃度抑制高濃度促進(jìn)的趨勢(shì)，即2 g·L-1濃度下葉綠素總含量的RI 值最小，抑制作用最強(qiáng)。 黃芩CAT 活性的RI 均為正值，呈促進(jìn)作用，而POD 活性的RI 則與其相反，呈抑制作用。 在2～10 g·L-1浸提液濃度之間黃芩的化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)值分別為0.060、0.007 和0.098，呈現(xiàn)“V”型變化趨勢(shì)。

表3 南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)的影響

不同濃度南方紅豆杉浸提液處理下紫花苜蓿種子萌發(fā)指標(biāo)的RI 多為負(fù)值，呈抑制趨勢(shì)；苗高的RI 值說明，其作用為“低抑高促”；根長的RI在10 g·L-1濃度下值最大，為0.283。 2 g·L-1浸提液濃度下紫花苜蓿MDA 含量、CAT 活性的RI 值最大，分別為0.585 和0.621。 在2～10 g·L-1浸提液濃度之間紫花苜蓿的化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)值為低濃度增大高濃度減小，2 g·L-1浸提液處理下SE 值為0.007，呈促進(jìn)趨勢(shì)。

10 g·L-1南方紅豆杉浸提液處理下牛蒡發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的RI 為正值，呈現(xiàn)促進(jìn)作用；苗高和根長的RI 隨著浸提液濃度增加而增大，呈現(xiàn)促進(jìn)趨勢(shì)，即在10 g·L-1濃度下RI 值最大，分別為0.522 和0.326。 牛蒡葉綠素總含量的RI 值說明，隨著浸提液濃度增加呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢(shì)。 牛蒡POD、CAT 活性的RI 分別在6 g·L-1和2 g·L-1濃度下達(dá)到最大值，分別為0.621 和0.649。6 g·L-1浸提液處理下牛蒡的SE 值最大，為0.242，具促進(jìn)作用。

3 討論

植物化感作用廣泛存在于生態(tài)系統(tǒng)中，通過對(duì)其研究能合理地解釋生態(tài)系統(tǒng)中植物種群分布、群落演替、協(xié)同進(jìn)化和生物入侵等現(xiàn)象[16]。而在化感作用性質(zhì)當(dāng)中，化感自毒作用嚴(yán)重影響著農(nóng)林業(yè)的發(fā)展。 藥用植物目前普遍存在化感自毒現(xiàn)象，通過向周圍和同種間釋放化學(xué)物質(zhì)來影響它們的正常生長[17]。 本研究中，南方紅豆杉浸提液對(duì)黃芩與牛蒡的化感綜合效應(yīng)均為正值，表現(xiàn)為促進(jìn)作用；而對(duì)紫花苜蓿的化感綜合效應(yīng)值呈現(xiàn)高濃度抑制趨勢(shì)，這與豬毛蒿(Artemisia scoparia)浸提液[18]和大狼毒(Euphorbia jolkinii)浸提液[19]對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)影響的相關(guān)研究結(jié)果一致，即隨浸提液濃度增加化感抑制作用增強(qiáng)。板栗(Castanea mollissima)葉水浸提液對(duì)黃芩種子發(fā)芽率的化感作用呈現(xiàn)“低促高抑”，其中20 g·L-1浸提液促進(jìn)作用最顯著，40 g·L-1浸提液顯著抑制其發(fā)芽[20]。 本試驗(yàn)中，黃芩能較好地適應(yīng)2～10 g·L-1南方紅豆杉浸提液，10 g·L-1浸提液化感綜合效應(yīng)值最大。 這說明此浸提液濃度范圍均促進(jìn)黃芩生長，下一步研究可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)大浸提液濃度范圍，探索最適黃芩生長的南方紅豆杉浸提液濃度。 人參(Panax ginsengC. A.Meyer)根系分泌物水對(duì)牛蒡種子萌發(fā)呈現(xiàn)“中低濃度促進(jìn)高濃度抑制”，其中10 μg·mL-1處理促進(jìn)作用最顯著[21]。 而本研究發(fā)現(xiàn)，6 g·L-1浸提液對(duì)牛蒡的化感綜合效應(yīng)值最大，促進(jìn)作用最強(qiáng)，說明受體牛蒡?qū)Σ煌参锏幕羞m應(yīng)性不同。 綜合以上南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物化感綜合效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，南方紅豆杉適宜與黃芩、牛蒡間作栽培，不適宜與紫花苜蓿間作栽培，與牛蒡間作要注意控制行間距、保持低密度種植。

關(guān)于不同濃度南方紅豆杉浸提液對(duì)受體植物光合色素含量的影響，本研究發(fā)現(xiàn)，6 g·L-1浸提液對(duì)受體牛蒡光合色素含量促進(jìn)作用最顯著，10 g·L-1浸提液提高受體黃芩光合色素含量的作用最顯著。 受體植物化感綜合效應(yīng)值最大的處理其葉綠素含量也最高。 不同濃度浸提液均抑制紫花苜蓿葉綠素含量，且隨浸提液濃度增高化感抑制作用越強(qiáng)，這與光葉紫花苕子(Vicia villosa)地上部和地下部浸提液均抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)的研究[22]結(jié)果一致。 這也說明植物葉綠素含量是反映植物營養(yǎng)脅迫、光合作用和生長狀況的重要指標(biāo)，對(duì)研究植物生理特性和抗性具有重要意義[23]。

植物受到逆境脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生膜脂過氧化，以最終產(chǎn)物丙二醛含量來反映植物在逆境下的受損程度。 CAT、SOD、POD 普遍存在于植物組織中，是植物抗氧化系統(tǒng)中的主要酶，通過防止膜脂過氧化來抑制高濃度氧的積累，維持植物的正常生長發(fā)育，有效延緩植物衰老[24]。 從本試驗(yàn)結(jié)果來看，黃芩保護(hù)酶CAT、SOD 活性隨著南方紅豆杉浸提液濃度增高而逐漸增加，POD 活性的變化趨勢(shì)則相反，10 g·L-1浸提液下黃芩POD 活性最低；10 g·L-1和6 g·L-1浸提液下黃芩MDA 含量較低，兩者之間差異不顯著，與CK 相比顯著降低。 這與10 g·L-1核桃(Juglans regiaL.)葉水浸液提高黃芩幼苗SOD、 CAT 活性且降低MDA 含量的結(jié)果較一致[25]。 本研究結(jié)果顯示，6 g·L-1浸提液下牛蒡MDA 含量和POD 活性最高，其CAT 活性與CK 相比顯著增加，SOD 活性有所增加但與CK 差異不顯著。 戴敏等[26]發(fā)現(xiàn)，高濃度Pb 脅迫下牛蒡MDA 含量最大時(shí)仍然具有較高的發(fā)芽率和保護(hù)酶活性，這說明牛蒡的抗氧化系統(tǒng)抵御逆境傷害能力較強(qiáng)。 植物體內(nèi)存在著許多感受不同逆境信號(hào)的受體，參與各種逆境脅迫響應(yīng)，并形成一個(gè)復(fù)雜的響應(yīng)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對(duì)逆境脅迫[27]。 抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)能力是臨時(shí)和有限的[28]。 受到脅迫時(shí)，植物會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)抗氧化能力的增強(qiáng)，這種適應(yīng)性的反應(yīng)只能夠在一定受害程度內(nèi)發(fā)揮作用，當(dāng)體內(nèi)氧化產(chǎn)物累積到一定水平時(shí)各種酶不能正常發(fā)揮作用導(dǎo)致酶活性下降，但不同植物的自身抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)能力和耐受程度不同，受體植物所感受到的化感物質(zhì)對(duì)自身的脅迫程度也不同，從而呈現(xiàn)不同的化感作用。

4 結(jié)論

南方紅豆杉浸提液對(duì)3 種藥用植物的化感作用強(qiáng)度不同，并且3 種藥用植物所呈現(xiàn)出的化感效應(yīng)也不同，其對(duì)黃芩與牛蒡的化感綜合效應(yīng)均為正值，其中6 g·L-1濃度對(duì)牛蒡的化感綜合效應(yīng)作用最顯著。 不同濃度南方紅豆杉浸提液會(huì)引發(fā)紫花苜蓿、黃芩、牛蒡種子萌發(fā)和生長過程中體內(nèi)保護(hù)酶和膜脂過氧化產(chǎn)物等物質(zhì)的變化。 受體植物和化感物質(zhì)濃度的不同會(huì)使其生理代謝物質(zhì)呈現(xiàn)出不同的化感現(xiàn)象。