楊林林韓敏琦高嘉楊勝敏

(1. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；2. 北京清河水利建設(shè)集團(tuán)有限公司，北京 100192)

活性氧(ROS)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·-)和過(guò)氧化氫(H2O2)等一系列副產(chǎn)物[1]。 ROS 是生物體所必需的信號(hào)分子，影響著細(xì)胞分化、凋亡及胞間物質(zhì)傳導(dǎo)。 正常條件下，細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；然而，植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)受到極端溫度、水分、鹽分、重金屬離子等各種脅迫，這往往會(huì)導(dǎo)致ROS 過(guò)量累積[2]。 ROS 的過(guò)量積累會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞膜脂、蛋白質(zhì)、核糖核酸和光合色素，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。 為了消除ROS 毒性并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷，植物已經(jīng)進(jìn)化出有效的機(jī)制來(lái)減輕損害[4]，如一些抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)等，可有效清除植物體內(nèi)過(guò)量的ROS，以維持植物體內(nèi)正常的生理代謝[5]。

SOD 是抗氧化防御系統(tǒng)的首位限速酶，可以通過(guò)催化O2·-歧化為H2O2和O2以減少ROS 造成的損害[6]。 生物體含有一系列SOD 同工酶，均屬于金屬蛋白酶。 根據(jù)催化位點(diǎn)金屬輔因子的不同，SOD 可分為四種類型，即Cu/Zn-SOD(CSD)、Mn-SOD(MSD)、Fe -SOD(FSD) 和Ni -SOD(NSD)[7]。 FSD 和MSD 主要存在于低等植物中，CSD 主要存在于高等植物中，NSD 存在于鏈霉菌、藍(lán)細(xì)菌和海洋生物中[8]。 這些SOD 分布在細(xì)胞的不同區(qū)域，在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SD 存在于線粒體和葉綠體中，MSD 主要存在于線粒體和過(guò)氧化物酶體，CSD 主要存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)，而NSD 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[9]。 目前，已對(duì)許多植物的SOD基因家族成員進(jìn)行了分子解析，包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)、丹參(Salvia miltiorrhiza)、玉米(ZeamaysL.)、煙草(Nicotiana tabacumL.)、水稻(Oryza sativaL.)等，結(jié)果表明，不同物種的SOD基因家族組成不同，同一物種的不同基因型間SOD組成亦存在一定差異；此外，同一類型的SOD基因在不同物種中作用也不盡一致[7，10]。

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上廣泛種植的谷類作物之一，含有高比例的碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)及膳食纖維，是全球85%以上人類和牲畜的主要食物原材料[11]。 然而，小麥產(chǎn)區(qū)往往處于干旱或半干旱環(huán)境，長(zhǎng)期灌溉和施肥使得土壤鹽漬化加劇，但現(xiàn)推廣的大多數(shù)小麥品種對(duì)土壤鹽的耐受性較低、敏感性較強(qiáng)[12]，這在一定程度上致使小麥產(chǎn)量和品質(zhì)顯著下降。 小麥SOD基因分析可為其抗性遺傳改良提供重要信息，然而到目前為止，在全基因組水平上檢測(cè)小麥SOD(TaSDs) 基因家族組成的研究較少。 本研究以‘西農(nóng)979’為試材，對(duì)小麥SOD基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并綜合分析TaSDs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因組內(nèi)的分布、基序組成、不同組織中的表達(dá)譜以及鹽脅迫下TaSDs響應(yīng)鋅鉀的功能作用，以期為進(jìn)一步研究小麥抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年12月在北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院技術(shù)示范區(qū)龐各莊實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。 供試小麥品種為‘西農(nóng)979’，種子來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院。 供試氯化鈉(NaCl)、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、氯化鉀(KCl)均購(gòu)自北京索萊寶化學(xué)生物試劑有限公司。

1.2 小麥SOD 基因家族成員的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 小麥SOD 基因的鑒定小麥的核苷酸、蛋白質(zhì)序列和基因注釋(General Feature Format Version 3， GFF)信息從IWGSC 公共數(shù)據(jù)庫(kù)(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies)獲取，并從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)(pfam.sanger.ac.uk/)下載小麥SOD 的DAN-binding 結(jié)構(gòu)域信息(PF00199)，將其結(jié)構(gòu)域信息保存為隱藏馬爾可夫格式(HMM)。 使用HMMER 3.0 搜索工具對(duì)HMM 進(jìn)行初步檢索與篩選[13]。 使用NCBI 保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)對(duì)HMM 進(jìn)行進(jìn)一步篩選，借助Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /pfam.xfam.org/)再次篩選以去除冗余、缺失或不正確的序列，得到最終的SOD 蛋白質(zhì)家族。 按照小麥基因命名指南(http:/ /wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/98/Intro.htm/)所述的分類方法對(duì)小麥SOD 蛋白質(zhì)家族進(jìn)行命名與分類，以得到TaSDs基因家族信息。

1.2.2 TaSDs 理化性質(zhì)表征分析采用ExPASy(https://web. expasy. org/protparam/) 和 WoLF PSORT 在線工具(https://www.genscript.com/wolfpsort.html)預(yù)測(cè)TaSDs的理化特性和亞細(xì)胞定位；根據(jù)各TaSDs在基因組注釋中的位置，使用Map-Inspect 軟件檢測(cè)TaSDs的染色體分布；根據(jù)Savadi 等[14]所述方法對(duì)TaSDs進(jìn)行基因重復(fù)分析。

1.2.3 TaSDs 系統(tǒng)發(fā)育分析為了進(jìn)一步闡明TaSDs與其他物種SOD基因家族(SDs)之間的進(jìn)化關(guān)系，下載并比較分析了擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea maysL.)、谷子(Setaria italica)和水稻(Oryza sativaL.)的SOD 蛋白序列。 使用MUSCLE 進(jìn)行全長(zhǎng)蛋白質(zhì)比對(duì)[15]，并借助MEGA-X 在線軟件(https://www. megasoftware.net/)采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.4 TaSDs 染色體定位及共線性分析從IWGSC 公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到小麥的GFF3 基因組注釋文件，借助MapInspect 軟件將TaSDs一一定位到染色體上，并獲得每條染色體的基因密度譜。借助TBtools 軟件將物種內(nèi)和不同物種之間的染色體定位和基因重復(fù)進(jìn)行可視化分析。

1.2.5 TaSDs 的保守結(jié)構(gòu)域、基序和啟動(dòng)子序列分析TaSDs 蛋白的保守域采用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 保守域搜索工具(CD Search)進(jìn)行檢測(cè)，使用GSDS 2.0 在線工具(http:/ /gsds.gao-lab.org/)檢測(cè)TaSDs家族成員的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，使用MEME 在線軟件(https://meme-suite.org/meme/)鑒定TaSDs的保守蛋白基序，使用TBtools 軟件可視化TaSDs的保守結(jié)構(gòu)域。 為了進(jìn)一步鑒定TaSDs啟動(dòng)子區(qū)域的推定順式調(diào)節(jié)元件，借助TBtools 軟件獲得TaSDs基因的起始密碼子上游2 000 kb 序列(2-kb 5')，采用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/ /bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)TaSDs的順式調(diào)控元件。

1.3 TaSDs 基因家族響應(yīng)不同鹽脅迫類型的表達(dá)分析

1.3.1 供試小麥培養(yǎng)方法小麥種子采用0.5%NaClO 進(jìn)行表面滅菌10 min，用去離子水沖洗數(shù)次并浸泡6 h，然后放置于鋪墊潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)箱暗處理催芽48 h。 催芽結(jié)束后，先用1/4Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培育4 d， 然后用1/2Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液[16]培育3 d，之后用150 mmol/L NaCl 處理小麥幼苗，1 h 后進(jìn)行相應(yīng)Zn、K 處理，其中，Zn、K 目標(biāo)離子均為200 mmol/L，對(duì)照(CK)則加入無(wú)菌水。 培養(yǎng)期間，光周期為10 h/14 h(晝/夜)，溫度為26 ℃。 每處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。 將小麥植株根系、地上部分開(kāi)后立即用液氮冷凍，并儲(chǔ)存于-80 ℃用于RNA 提取。

1.3.2 小麥RNA 的提取 將小麥樣品(250 mg)在液氮中快速研磨，按照Plant RNAiso Plus 提取試劑盒(Omega)相關(guān)說(shuō)明提取小麥總RNA，采用Nano Drop 2000 紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000，USA)檢測(cè)RNA 濃度，采用2%葡萄糖檢驗(yàn)RNA 質(zhì)量。

1.3.3 小麥RT-qPCR 分析將質(zhì)檢合格的RNA用帶有g(shù)DNA Eraser (TaKaRa RR047Q，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)的PrimeScript RT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 將cDNA 用無(wú)菌水稀釋100 倍，作為后續(xù)RT-qPCR 的模板。 相關(guān)引物(表1)采用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，以Actin(Gene ID:AB181991)作為內(nèi)參基因。 RT-qPCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照劉佳月等[17]所述，使用Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories Inc.， USA)的C1000 Touch PCR 熱循環(huán)儀和CFX Connect 實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR 分析，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔。 用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。 使用Origin 2020 軟件繪圖。

表1 小麥基因的qRT-PCR 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥SOD 基因家族理化性質(zhì)特征分析

經(jīng)Blast 序列比對(duì)、除冗余和蛋白結(jié)構(gòu)域篩選后，共挖掘出10個(gè)SOD家族成員，按照基因在染色體上的初步預(yù)測(cè)位置及命名指南，將其分別命名為TaCSD1～TaCSD4、TaFSD1 ～TaFSD4、TaMSD1 ～TaMSD2。 由表2 可知，小麥SOD基因家族蛋白質(zhì)長(zhǎng)度152 ～382 aa，分子量在15.17 ～42.87 kDa之間；等電點(diǎn)為5.33 ～8.84，其中僅TaFSD2、TaFSD3 為堿性蛋白(等電點(diǎn)大于7)，其余均為酸性蛋白。 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，TaCSD1、TaCSD2 蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，TaCSD3、TaCSD4、TaFSD4 則位于葉綠體中，其余5個(gè)TaSDs 均位于線粒體中。

表2 小麥SOD 基因家族理化性質(zhì)

2.2 TaSDs 基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分類

為了進(jìn)一步研究雙子葉植物和單子葉植物中SOD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于37個(gè)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列的比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中包括小麥的10個(gè)序列、玉米的3個(gè)序列(ZmFSD1、ZmCSD1、ZmCSD2)、谷子的8個(gè)序列(SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4、SiFSD1、SiFSD2、SiFSD3 和SiMSD)、水稻的8個(gè)序列(cCuZn-SOD1、cCuZn-SOD2、CuZn-SOD-L、pCuZn-SOD、CuZn-SOD-CCh、Fe-SOD3、Fe-SOD2 和Mn-SOD1)、擬南芥的8個(gè)序列(AtCSD1、AtCSD2、AtCSD3、 AtFSD1、 AtFSD2、 AtFSD3、 AtMSD1 和AtMSD2)。 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，這37個(gè)SOD 蛋白可分為兩組，Ⅰ組為Fe/MnSODs，Ⅱ組為Cu/ZnSODs，與它們所包含的結(jié)構(gòu)域類型一致(圖2)。Ⅰ組包含19 種SOD 蛋白，可進(jìn)一步分為3個(gè)亞組；在Ⅱ組中，18 種SOD 蛋白分為4個(gè)亞組。 聚集在同一亞組中的大多數(shù)SOD 蛋白具有較為相同的亞細(xì)胞定位(表2)，例如，在線粒體的FSDs(TaFSD1、TaFSD2、TaFSD3)、MSDs(TaMSD1、TaMSD2)分別聚為a、c 亞群。 此外，在每個(gè)亞組中，我們發(fā)現(xiàn)TaSDs 與玉米、谷子及水稻的關(guān)系比擬南芥更密切。

圖1 5個(gè)物種SOD 家族系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 TaSDs 基因家族編碼蛋白的基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

2.3 TaSDs 基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3.1 TaSDs 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析使用GSDS 2.0 在線工具分析了35個(gè)SOD基因組(圖2A)的結(jié)構(gòu)信息，即所有序列中的外顯子-內(nèi)含子數(shù)量和分布。 由圖2B 可知，外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量在單子葉和雙子葉植物的基因之間存在較大差異，外顯子的數(shù)量為1 ～9 不等。 水稻、高粱、玉米和小麥的SOD基因有1～8個(gè)外顯子，擬南芥和油菜的SOD基因有7～9個(gè)外顯子，而所有TaSDs都具有1～7個(gè)內(nèi)含子和2～7個(gè)外顯子。

為了更好地了解SOD基因家族，使用NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SOD 蛋白的保守域進(jìn)行分析，并構(gòu)建所有SOD 蛋白結(jié)構(gòu)的示意圖(圖2C)，可見(jiàn)，所有SOD 蛋白均包含一個(gè)超氧化物歧化酶核心結(jié)構(gòu)域(PF00199，Superoxide dismutase)和一個(gè)超氧化物歧化酶免疫反應(yīng)結(jié)構(gòu)域(PF06628，Superoxide dismutase-rel)，且來(lái)自不同物種的SOD基因具有高度的序列和基因結(jié)構(gòu)相似性，揭示了SOD基因家族成員之間的進(jìn)化仍具有保守性。

2.3.2 TaSDs 基因保守蛋白質(zhì)基序分析由圖3可知，CSD 的所有保守結(jié)構(gòu)域的bits 值皆大于1，表明TaSDs 蛋白中的8個(gè)氨基酸(甘氨酸、亮氨酸、組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和脯氨酸)基序均為保守結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基序。 類似的，F(xiàn)SD 包括8個(gè)保守氨基酸(纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和組氨酸)，而MSD 則包括FSD 和鐵基的保守金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域DVWEHAYY。 以上結(jié)果表明，小麥SOD基因家族中的不同亞家族(CSD、FSD、MCD)含有其特有的氨基酸序列組成，且均包括一系列高度保守的活性位點(diǎn)殘基，這些殘基可能在催化離子(如Fe2+、Zn2+)的序列特異性結(jié)合中發(fā)揮作用。

圖3 TaSDs 基因保守蛋白質(zhì)基序分析

2.4 TaSDs 基因的染色體定位

為了確定TaSDs基因在染色體上的位置及相關(guān)基因擴(kuò)增片段區(qū)域，基于小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)IWGSC 的最新數(shù)據(jù)，以97%的序列映射到染色體以及無(wú)法映射到任何染色體的為錨定支架，結(jié)果(圖4)顯示10個(gè)TaSDs基因中，除TaFSD4外，其余9個(gè)SOD基因均可被定位到小麥染色體上，且該9個(gè)基因不均勻地分布在8個(gè)不同染色體臂的遠(yuǎn)端區(qū)域；其中，TaCSD3和TaMSD1聚集成串聯(lián)重復(fù)事件區(qū)域，但這些串聯(lián)基因在任何其他亞基因組中都沒(méi)有同源拷貝。 此外，TaSDs基因家族擴(kuò)增和重復(fù)之間的關(guān)系顯示，TaFSD2、TaFSD3、TaFSD1為同源基因；TaCSD2、TaCSD1、TaCSD4為同源基因，且與TaFSD2、TaFSD3、TaFSD1構(gòu)成不同的同源基因組。 這些結(jié)果表明TaSDs家族的進(jìn)化是由片段復(fù)制和基因串聯(lián)事件驅(qū)動(dòng)的。

圖4 TaSDs 基因的染色體定位

2.5 TaSDs 基因啟動(dòng)子中的順式元件分析

結(jié)果(圖5)表明，除一些光照、細(xì)胞分化調(diào)控等基本核心元件外，TaSDs 還含有激素反應(yīng)元件(ABA、GA、SA、Me-JA)以及缺氧或厭氧誘導(dǎo)元件等，這些順式作用元件是非生物應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。 例如，TaCSD1、TaCSD4含有與冷脅迫相關(guān)的順式元件，而TaFSD3、TaFSD4、TaCSD4、TaMSD2含有水楊酸(SA)反應(yīng)元件；TaFSD2、TaCSD2、TaCSD3的啟動(dòng)子特異地含有一個(gè)與分生組織表達(dá)相關(guān)的元件，表明其可能與分生組織的發(fā)育有關(guān)。 此外，在大多數(shù)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如MYB 結(jié)合位點(diǎn)，表明TaSDs基因可能受MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。 總的來(lái)說(shuō)，同一類別的TaSDs基因可能具有不同的作用方式，并且不同類別的基因也可能具有協(xié)同作用。

圖5 TaSDs 基因啟動(dòng)子的順式元件分析

2.6 TaSDs 基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

由圖6 可知，鹽脅迫(NaCl)和無(wú)鹽脅迫對(duì)照(CK)條件下，TaFSD4、TaMSD2、TaFSD3在小麥地上部(shoot)和根系(root)中均具有較高的表達(dá)水平，而TaFSD1均不表達(dá)。TaCSD2僅在鹽脅迫0、12、24 h 的小麥根系中高表達(dá)。TaMSD1、TaCSD4、TaCSD1均在小麥根系中表達(dá)。 特別的，TaCSD3、TaFSD2在鹽脅迫12、24 h 的根系、地上部中高表達(dá)，而在鹽脅迫0 h 及對(duì)照的根系、地上部不表達(dá)或極低表達(dá)，初步表明這兩個(gè)基因可能參與了鹽脅迫的調(diào)控，應(yīng)在后續(xù)研究中予以重視。

圖6 TaSDs 基因在鹽脅迫和對(duì)照小麥不同部位的Heatmap 分析

2.7 TaCSD3 基因在鹽脅迫下及響應(yīng)鋅鉀的表達(dá)分析

根據(jù)TaSDs表達(dá)譜分析結(jié)果，選擇可能參與鹽脅迫調(diào)控的TaCSD3，進(jìn)一步研究其在鹽脅迫下的表達(dá)水平及響應(yīng)Zn、K 的表達(dá)情況。 由圖7 可知，無(wú)論在無(wú)鹽脅迫處理(CK)還是無(wú)鹽脅迫處理下的相關(guān)鋅鉀處理(Zn、K、Zn+K)中，TaCSD3在小麥根系和地上部中均幾乎不表達(dá)；而在150 mmol/L NaCl 處理下，TaCSD3表達(dá)水平較CK 顯著升高，增施Zn、K 后其表達(dá)水平進(jìn)一步顯著提高，在同時(shí)增施Zn 和K 處理下最高，即無(wú)論是在根系還是地上部中各處理表現(xiàn)為NaCl＜NaCl+K＜NaCl+Zn＜NaCl+Zn+K，且TaCSD3在根系的表達(dá)水平明顯高于地上部。TaCSD3在不同組織中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了上述TaSDs基因表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性，同時(shí)表明TaCSD3是響應(yīng)鹽脅迫的指示性SOD基因，同時(shí)受Zn、K 正向調(diào)控。

圖7 TaCSD3 基因在鹽脅迫下響應(yīng)鋅鉀的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

小麥?zhǔn)鞘澜绲诙蠹Z食作物，對(duì)保障人類糧食安全具有重要意義[11]。 然而，小麥生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量易受到土壤鹽漬帶來(lái)的不利影響。 在植物防御系統(tǒng)中， SOD 在清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的活性氧自由基中發(fā)揮著重要作用[6-8，18]。 已在多種植物物種中進(jìn)行了SOD家族基因的研究，鑒定小麥SOD基因并確定其在鹽脅迫響應(yīng)中的功能可為小麥抗鹽育種提供優(yōu)良的基因靶點(diǎn)。 本研究基于pfam搜索和蛋白質(zhì)Blast 對(duì)比，在小麥品種‘西農(nóng)979’中鑒定出10個(gè)SOD基因(TaSDs)，包括4個(gè)Cu/Zn-SODs 基因(TaCSDs)、4個(gè)Fe-SODs 基因(TaFSDs)和2個(gè)Mn-SODs 基因(TaMSDs)；這些蛋白質(zhì)長(zhǎng)度在152 ～382 aa，分子量在15.17 ～42.87 kDa，且多為酸性蛋白，主要分布于線粒體、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)中。SOD基因的數(shù)量因植物而異，水稻、高粱和番茄中往往更少，這種差異可能歸因于基因重復(fù)(串聯(lián)和節(jié)段重復(fù))[7，19]。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，5個(gè)物種的37個(gè)SOD 蛋白可以分為Fe/Mn-SODs 和Cu/Zn-SODs 兩組，其中，前者包含19個(gè)SOD 蛋白，可進(jìn)一步分為3個(gè)亞組；后者包含18個(gè)SOD 蛋白，可分為4個(gè)亞組。 此外，來(lái)自單子葉植物(小麥、玉米、谷子和水稻)和雙子葉植物(擬南芥)的SOD 更傾向于分散分布，且單子葉植物的SOD 更易聚集在Fe/Mn-SODs 組中，表明這些基因可能共享共同的祖先基因。 然而，一些小麥SOD 與其旁系同源蛋白以外的其他物種的直系同源物表現(xiàn)出密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明其與這些直系同源物可能起源于共同的祖先，并在早期基因組變異后分化。

基因結(jié)構(gòu)已被確定為基因家族進(jìn)化的代表性標(biāo)志之一[20]。 本研究結(jié)果表明，TaSDs的外顯子和內(nèi)含子在單子葉植物和雙子葉植物之間亦存在差異，所有TaSDs都具有1～7個(gè)內(nèi)含子和2～7個(gè)外顯子。 前人研究也表明，一個(gè)SOD基因的祖先拷貝有7個(gè)內(nèi)含子[21]。 可見(jiàn)，TaSDs基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了外顯子和內(nèi)含子的變化，相應(yīng)的TaSDs含有超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)域。 此外，TaSDs的不同亞家族(CSD、FSD、MCD)有各自特有的氨基酸序列組成，包含一系列高度保守的活性位點(diǎn)殘基。 以上結(jié)果表明這些基因在進(jìn)化過(guò)程中是保守的。

基因串聯(lián)重復(fù)事件經(jīng)常發(fā)生在植物進(jìn)化過(guò)程中，與片段重復(fù)事件共同被認(rèn)為是增加基因家族多樣性的關(guān)鍵機(jī)制，而基因重復(fù)在SOD基因的多樣化擴(kuò)展中亦起著至關(guān)重要的作用[22]。 本研究中，除TaFSD4外，其余9個(gè)SOD基因均被定位到8個(gè)不同的染色體上；發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)的SOD基因?qū)?，即TaCSD3與TaMSD1，該兩基因在任何其他亞基因組中均沒(méi)有同源拷貝。 一般而言，單子葉植物基因應(yīng)在亞基因組中同時(shí)具有3個(gè)同源拷貝[7]；然而TaCSD3、TaMSD1僅為兩個(gè)，這可能是小麥α-型亞基在染色體之間發(fā)生易位以及進(jìn)化過(guò)程中基因組多倍化和基因復(fù)制的結(jié)果[23]。

基因表達(dá)受許多參與各種途徑的順式作用元件和反式作用因子的相互作用調(diào)節(jié)[8]。 前人研究已經(jīng)證實(shí)，一些SOD基因可被不同的元件途徑所誘導(dǎo)，例如寒冷、高溫、激素[21，24-25]等。 本研究結(jié)果表明，TaSDs基因啟動(dòng)子包含各種應(yīng)激反應(yīng)元件，如冷反應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)元件；一些TaSDs啟動(dòng)子還包括MYB 結(jié)合位點(diǎn)，表明這些SOD基因可能受MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)；此外，一些TaSDs基因啟動(dòng)子中還發(fā)現(xiàn)了一些響應(yīng)分生組織表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控以及光、激素(ABA、SA、GA、Me-JA、IAA) 反應(yīng)的元件，表明TaSDs基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧代謝網(wǎng)絡(luò)參與植物生長(zhǎng)和細(xì)胞分化。

礦質(zhì)養(yǎng)分在提高植物的鹽脅迫耐受性方面起著重要作用。 鉀(K)是一種常量營(yíng)養(yǎng)元素，在調(diào)節(jié)植物生理生化中起著重要作用，K+與Na+往往共用同類運(yùn)輸?shù)鞍?，因此增加?duì)K+的攝取可以降低對(duì)Na+的吸收，從而避免鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和相關(guān)細(xì)胞損傷[26]。 鋅(Zn)是重要的微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是Cu/Zn-SODs 亞家族編碼蛋白特殊位點(diǎn)的重要催化物質(zhì)之一[27]，能最大限度地減少鹽堿化的有害影響，降低NADPH 氧化酶的活性以減少活性氧的產(chǎn)生，從而減輕膜脂過(guò)氧化[28]。 Zn、K在基因調(diào)控、蛋白質(zhì)合成、降低氧化損傷和DNA轉(zhuǎn)錄中均起著關(guān)鍵作用[26，29]。 本研究中，基于RNA 轉(zhuǎn)錄組的Heatmap 分析顯示，TaCSD3基因可能參與鹽脅迫的調(diào)控；進(jìn)一步的RT-qPCR 分析顯示，TaCSD3在無(wú)鹽脅迫下不表達(dá)，而在鹽脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，且受Zn、K 的誘導(dǎo)進(jìn)一步上調(diào)表達(dá)，在NaCl+Zn+K 處理下表達(dá)水平最高。 表明TaCSD3是影響鹽脅迫的靶向SOD基因，同時(shí)受Zn、K 正向調(diào)控。 本研究結(jié)果為未來(lái)研究小麥SOD 蛋白在生物過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)，也為小麥在鹽脅迫育種方面的改良提供了理論依據(jù)。