王小娟，鄒 晨，戴小軍,,3，劉延慶,3，張曉春，吳永健，王珊珊

（1.揚州大學臨床中醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州市中醫(yī)院，江蘇 揚州 225012；3.國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009）

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，較強的腫瘤異質性與較高的復發(fā)率、轉移率是胃癌預后較差的重要原因[1]。中西醫(yī)結合治療胃癌是我國惡性腫瘤綜合治療的特色與優(yōu)勢，中醫(yī)辨證論治能夠有效改善患者的臨床癥狀與預后。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，了解不同中醫(yī)證型的分子病理特征有助于深化對胃癌中醫(yī)理論的基礎研究與抗腫瘤中藥的精準選擇[2]。P2RX7（Purinergic Receptor P2X, Ligand-Gated Ion Channel, 7）是一種跨膜受體蛋白，廣泛分布于細胞膜表面。研究表明，P2RX7在實體癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中具有廣泛的生物學功能，能在腫瘤細胞的發(fā)育和擴散中發(fā)揮關鍵作用，為腫瘤發(fā)生和進展的重要介質[3-4]。

本研究采用免疫組化檢測胃癌組織中P2RX7蛋白的表達狀態(tài)，并結合患者的中醫(yī)辨證分型，以及患者的年齡、性別、腫瘤家族史、Lauren分型和TNM分期等臨床特征，分析P2RX7蛋白的表達及各臨床因素與中醫(yī)脾虛毒蘊證之間的相關性，旨在探討胃癌脾虛毒蘊證的分子生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2021年1—12月在揚州市中醫(yī)院就診的未經任何治療的新發(fā)胃癌患者80例。所有患者均根據(jù)《胃癌診療規(guī)范（2018年版）》[5]中胃癌診斷標準進行診斷，以患者的胃鏡或手術病理報告為明確診斷的依據(jù)。臨床病理分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）胃癌TNM分期第八版。本研究經過揚州市中醫(yī)院倫理審查（編號：2021-26）。

1.2 中醫(yī)辨證分型標準 根據(jù)《惡性腫瘤中醫(yī)診療指南》[6]的診斷要點，并在課題組專家指導下擬定胃癌脾虛毒蘊證辨證標準。（1）主癥：①納呆食少；②胃脘疼痛；③腹脹；④口臭。（2）次癥：①肢體倦怠乏力；②形體消瘦或浮腫；③面色晦暗無華；④便溏。（3）舌脈：舌淡胖或紅或暗，苔黃或白膩，脈細數(shù)或弦滑。凡具備3項主癥，或2項主癥和2項次癥，結合舌脈即可診斷為脾虛毒蘊證。非脾虛毒蘊證包括肝胃不和證、胃熱陰虛證、氣血虧虛證、脾胃虛寒證等。

1.3 納入標準 （1）病理診斷為胃腺癌；（2）TNM分期明確；（3）發(fā)病年齡18～75歲；（4）KPS評分≥60分；（5）依從性較好，同意提供組織學樣本，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 （1）多重癌癥患者；（2）合并有心肌梗死、腦梗死、嚴重肝腎功能不全等急慢性疾病的患者；（3）妊娠、哺乳期婦女；（4）精神病患者。

1.5 主要試劑與設備 山羊抗人P2RX7多克隆抗體（1∶100）（美國Abcam公司，批號：GR50237-25）；SP法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：17A07F21L0623）；DAB顯色試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：224020110）；蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20211230）；免疫組化專用粘附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，批號：80312-3161）；自動脫水機（型號：TP1020）、石蠟包埋機（型號：EGHH50H）、切片機（型號：RM2235）均購自美國Thermo公司；電熱鼓風恒溫烤箱（上海醫(yī)用恒溫設備廠，型號：DGX-9143B-21）；電熱恒溫水浴箱[邦西儀器科技（上海）有限公司，型號：HH-2]；微波爐（美的集團股份有限公司，型號：MM823EE2-PS00000472）；正置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司，型號：ECLIPSE 801）。

1.6 免疫組織化學染色 胃癌病理標本來自于2021年1—12月在揚州市中醫(yī)院就診的未經任何治療的80例新發(fā)胃癌患者?；颊咄馓峁┙M織學樣本，并簽署知情同意書。胃癌組織離體后立即沖洗，修剪，固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，連續(xù)切片厚度約4 μm，45 ℃水浴鍋中展片，撈片。溫箱60 ℃烤片2 h，脫蠟復水；滴加3%H2O2溶液覆蓋組織，避光，室溫中孵育10 min，PBS清洗；將組織浸入0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液中高溫煮沸6 min，PBS清洗；免疫組化標記筆固定組織范圍，用兔血清封閉液覆蓋組織，置于濕盒內于37 ℃孵育20～30 min，不洗；孵一抗，濕盒內4 ℃冰箱過夜；PBS清洗，孵二抗，濕盒置于37℃的恒溫箱內孵育30 min；PBS清洗，滴加SABC（鏈霉親和素-生物素復合物）覆蓋組織，37 ℃，孵育30 min；PBS清洗，DAB顯色，顯微鏡實時觀察細胞狀態(tài)以確定最終顯色時間，用雙蒸水充分清洗終止顯色；用含乙醇的蘇木精復染；脫水及透明；中性樹脂封片；拍照。

1.7 結果判定 在光學顯微鏡下，根據(jù)切片腫瘤細胞染色強度計算分值；在Image J中分析陽性細胞比例計算分值。分值標準如下。（1）染色強度：無著色，計0分；淡黃色，計1分；棕黃色，計2分；黃褐色，計3分。（2）腫瘤細胞中陽性細胞比例：未染色，計0分；0%～≤10%，計1分；10%～≤50%，計2分；50%～≤75%，計3分；＞75%，計4分。評分=染色強度評分×陽性細胞百分率評分。評分范圍為0～12分。結果判定標準：0～1分為陰性；2～3分為弱陽性；4～6分為中等陽性；＞6分為強陽性。0～3分為低表達；4～12分為高表達。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Pearson分析系數(shù)進行相關性分析，采用Logistic回歸進行脾虛毒蘊證的危險因素分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌患者的臨床特征 脾虛毒蘊證胃癌患者腫瘤家族史、P2RX7表達、TNM分期與非脾虛毒蘊證胃癌患者比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；年齡、性別、腫瘤部位、Lauren分型比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 80 例胃癌患者的臨床基本特征

單因素Logistic回歸分析顯示脾虛毒蘊證胃癌患者的腫瘤家族史（P=0.000）、P2RX7高表達（P=0.000）、TNM分期（P=0.000）與非脾虛毒蘊證胃癌患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；年齡（P=0.215）、性別（P=0.194）、腫瘤部位（P=0.109）、Lauren分型（P=0.695）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。P2RX7蛋白高表達、腫瘤家族史和TNM分期均是影響胃癌脾虛毒蘊證的危險因素，而年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、Lauren分型不是危險因素。

2.2 胃癌組織中P2RX7表達分布特征 在40倍的光鏡下觀察，胃癌P2RX7蛋白定位于細胞膜和細胞質，免疫組織化學染色呈棕褐色。（見圖1）80例胃癌患者中，P2RX7蛋白表達陰性者9例（11.25%），弱陽性表達24例（30.00%），陽性表達31例（38.75%），強陽性表達16例（20.00%）。本研究將P2RX7蛋白表達陰性和弱陽性者視為低表達，陽性表達和強陽性表達視為高表達。其中，低表達者33例，高表達者47例。

圖1 P2RX7 蛋白在胃癌組織中的表達情況（免疫組化，×40）

2.3 P2RX7與胃癌脾虛毒蘊證的關系

2.3.1 脾虛毒蘊證患者P2RX7表達與非脾虛毒蘊證比較 胃癌脾虛毒蘊證患者的P2RX7蛋白表達水平顯著高于胃癌非脾虛毒蘊證患者（P＜0.05）。（見表2）

2.3.2 胃癌脾虛毒蘊證與P2RX7表達的相關性 Pearson相關性分析顯示P2RX7與胃癌脾虛毒蘊證具有一定的相關性（R2=0.253，P＜0.01）。將年齡、性別、腫瘤家族史、P2RX7蛋白表達水平、腫瘤部位、Lauren分型及TNM分期7個因素納入多因素Logistic回歸模型分析，進行變量篩選。P2RX7蛋白高表達和腫瘤家族史是胃癌患者脾虛毒蘊證的獨立危險因素，而TNM分期中的Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ期更容易使胃癌患者發(fā)生脾虛毒蘊。（見表3）

表3 Logistic 回歸分析參數(shù)估計值

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位列全球惡性腫瘤發(fā)病率第五，相關死亡率位列第四[7]。國家腫瘤中心預測2022年我國將有50.9萬人確診胃癌，相關死亡人數(shù)預估有40萬，發(fā)病率和死亡率在常見癌癥中均排第三位[8]。盡管近些年來胃癌的發(fā)病率在下降，綜合治療策略在不斷更新發(fā)展，但胃癌的預后仍然較差。

中醫(yī)學中雖無胃癌病名的記載，但關于其證候描述、病因病機的記載卻十分豐富。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，胃癌可歸屬于中醫(yī)學中“噎膈”“胃反”“翻胃”“積聚”等范疇。陰虛痰凝毒結是晚期胃癌的核心病機，胃陰不足為疾病進展之根本，痰凝毒結、聚散流竄為標且貫穿其始終[9]。經過歷代中醫(yī)學家的不斷豐富發(fā)展，目前多數(shù)研究者從“健脾益氣”“清熱解毒”“化痰散結”“化瘀解毒”等治法出發(fā)，在基礎研究和臨床研究中取得了豐富的成果[10-14]。在本研究的80例胃癌患者中，脾虛毒蘊證36例，占45.00%，顯著高于其他證型，與多位醫(yī)家的辨治思路存在一致之處[15-17]。

慢性炎癥和免疫抑制是腫瘤微環(huán)境形成的核心特征，是激發(fā)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素。韓欽芮等[18]通過梳理文獻發(fā)現(xiàn)，脾虛患者存在慢性炎癥，癌癥患者在脾虛狀態(tài)下存在免疫抑制反應。程海波等[19]認為腫瘤微環(huán)境中的炎癥微環(huán)境可能是熱毒的表現(xiàn)，而痰濕毒邪也與腫瘤微環(huán)境中黏附因子的表達密切相關；劉磊等[20]認為惡性腫瘤中的“痰毒”與腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）分泌多種因子的病理過程密切相關。此外，腫瘤患者的血液普遍存在高凝狀態(tài)，與癌細胞特異性促血栓形成特性及宿主細胞炎癥反應有關[21]。這可能是瘀毒內阻的表現(xiàn)。瘀毒內阻導致氣血津液運行不暢，機體能量利用與代謝障礙，產生低氧微環(huán)境。低氧微環(huán)境會增加低氧誘導因子（HIF-1α）的分泌，進而誘導新生血管形成，有利于腫瘤細胞的生長與轉移。研究顯示，中藥能夠調節(jié)癌癥患者的免疫功能，提升機體抗癌能力。中藥對胃癌機體免疫的影響主要體現(xiàn)在降低Treg細胞的免疫抑制，提高CD4+、CD8+效應細胞表達，調節(jié)細胞因子及免疫球蛋白等方面[22]。BAROJA-MAZO A等[23]發(fā)現(xiàn)P2X7激活后，可抑制NK細胞的抗腫瘤效力。綜上所述，脾虛毒蘊可能是腫瘤微環(huán)境形成的關鍵病機。有研究[24]表明調節(jié)腫瘤微環(huán)境的生化成分是癌癥治療的新前沿。在生理條件下，ATP在體內的濃度較低，不足以激活P2RX7。當惡性腫瘤發(fā)生時，腫瘤細胞會向細胞外基質中釋放大量ATP，導致TME中ATP濃度升高，過度激活P2RX7。由于P2RX7在構成TME的不同細胞類型中廣泛表達，P2RX7的過度激活會導致細胞膜上的離子通道開放，使Na+和Ca2+流入，K+流出，進一步激活參與細胞內信號轉導通路的酶和激酶（如c-Jun、PKA、PKC、PLA、ATK、JNK、MAPK、ERK1/2和p38等），誘導炎癥因子（如TNF-α、IL-10、IL1β、NALP3和Caspase-1/2等）的釋放，最終促進腫瘤細胞的生長、增殖、遷移和侵襲[25]。目前P2RX7與腫瘤之間的內在聯(lián)系已被廣泛認識，其中胃癌的預后也與其相關[26-27]。

本研究中，P2RX7高表達47例，占58.75%（47/80），表明胃癌組織中P2RX7處于高表達狀態(tài)。此外，本研究結果證明了脾虛毒蘊是胃癌最常見的病理因素，且發(fā)現(xiàn)P2RX7表達狀態(tài)與脾虛毒蘊證相關。P2RX7高表達可能是胃癌脾虛毒蘊證的分子機制之一，P2RX7高表達和有腫瘤家族史是胃癌患者有脾虛毒蘊證的獨立高風險因素，并且晚期胃癌更容易發(fā)展成脾虛毒蘊證。

綜上所述，P2RX7可作為免疫組化的檢測指標協(xié)助胃癌的臨床診斷，并可作為胃癌脾虛毒蘊證的監(jiān)測指標，有助于更好地協(xié)助胃癌的臨床治療。