李 帆，楊 瀅，緱慧君，許雪峰，楊 涵

（漢中市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，陜西 漢中 723000）

小兒感冒寧糖漿由金銀花、連翹、牛蒡子、黃芩等15種藥材組成，具有疏散風(fēng)熱、清熱止咳的功效，臨床多用于治療小兒外感風(fēng)熱所致的感冒。癥狀為發(fā)熱、汗出不爽、鼻塞流涕、咳嗽咽痛等[1]。2020年版《中華人民共和國藥典》一部僅以黃芩苷這一單一成分來進(jìn)行質(zhì)量控制，并且在目前所能查到的文獻(xiàn)中也僅對其4種成分進(jìn)行定量分析[2]。對于成分復(fù)雜的兒童用藥來說，僅靠控制單一的中藥有效成分群的含量，難以客觀并全面地評價產(chǎn)品的質(zhì)量[3]。本研究建立了小兒感冒寧糖漿中綠原酸、梔子苷、連翹苷、牛蒡苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的一測多評（QAMS）法，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)物，通過測定黃芩苷的含量，得出其他7種成分的含量。本法簡單準(zhǔn)確，在降低含量測定檢驗(yàn)成本的同時縮短了檢驗(yàn)時間，為小兒感冒寧糖漿的質(zhì)量控制提供了新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器（美國賽默飛公司）；島津LC-20A型高效液相色譜儀，配備SPD-20A檢測器（日本島津公司）；賽多利斯BS224S、BT-25S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度分別為萬分之一、十萬分之一）；KQ-250DE型超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山市超聲儀器有限公司，功率：400 W，頻率：40 kHz）；TDL80-2B型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）。

圖1 HPLC 圖

1.2 試劑與試藥 小兒感冒寧糖漿（批號：20200410，20200320）購于吉林益民堂制藥有限公司；小兒感冒寧糖漿（批號：200301，210301）購于成都迪康藥業(yè)有限公司。綠原酸對照品（批號：110753-202018，純度：99.3%）、梔子苷對照品（批號：110749-201919，純度：97.6%）、牛蒡苷對照品（批號：110819-201812，純度：95%）、連翹苷對照品（批號：110819-202117，純度：94.9%）、黃芩苷對照品（批號：110715-202122，純度：94.2%）、漢黃芩苷對照品（批號：112002-201702，純度：98.5%）、黃芩素對照品（批號：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素對照品（批號：111514-201706，純度：98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇（德國Merck公司）；優(yōu)級純磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；超純水經(jīng)Milli-Q integral5純水機(jī)制備；陰性對照品藥材：薄荷（批號：2011016）、荊芥穗（批號：2106001）、苦杏仁（批號：20220101)、牛蒡子（批號：200601）、黃芩（批號：20220302）、桔梗（批號：211002）、前胡（批號：20130301）、白芷（批號：211101-03）、炒梔子（批號：C232220501）、焦山楂（批號：200101）、六神曲（批號：211001A50）、焦麥芽（批號：2101001）、蘆根（批號：20220201）、金銀花（批號：200701）、連翹（批號：Y220301）均購置于漢中市人民醫(yī)院，并由本課題組許雪峰副主任藥師、緱慧君副主任藥師鑒定為正品，且所有藥材經(jīng)檢測均符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters XSelect HSS T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0~5.0 min，13.0%A~32%A；5.0~40.0 min，32%A~70%A；40.0~60.0 min，70%A~13%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為227、327 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，加70%甲醇制成綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為0.57 00、0.812 0、2.202 0、0.514 4、2.223 1、0.910 0、0.512 0、0.375 0 mg/mL的混合對照品儲備液；精密吸取1 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，即得綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為57.00、81.20、220.20、51.44、222.31、91.00、51.20、37.50 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品約6 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加70%甲醇適量，搖勻，超聲處理30 min，放冷至室溫，加70%甲醇至刻度，2 000 r/min離心10 min，精密量取上清液5 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，濾過，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備 按照小兒感冒寧糖漿的制備工藝和處方，分別制備缺金銀花、梔子、牛蒡子、連翹、黃芩的陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2”項下各溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰分離度均大于1.5，不對稱度在0.99~1.01之間，理論塔板數(shù)按黃芩苷計不低于90 962，各陰性對照品在相應(yīng)位置均無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系及檢測限、定量限的確定 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品儲備液0.1、1、2、3、4、5 mL置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，制成不同濃度的混合對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。用甲醇逐步稀釋混合對照品溶液并進(jìn)樣，以信噪比為3時的含量為檢測限，信噪比為10的含量為定量限。（見表1）

表1 8 種成分的線性關(guān)系和檢測限、定量限

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一批小兒感冒寧糖漿樣品（批號：20200410），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄各組分的峰面積，測得綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.52%、0.22%、0.95%、0.86%、0.11%、0.46%、0.53%、0.44%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批小兒感冒寧糖漿樣品（批號：20200410），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、8、12、18、24、32 h按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品峰面積RSD分別為0.56%、1.26%、0.09%、0.92%、0.11%、0.17%、1.86%、1.54%。表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批小兒感冒寧糖漿樣品（批號：20200410），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣，測定并計算各成分的含量。結(jié)果綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的RSD分別為0.93%、0.88%、1.81%、0.94%、1.09%、1.44%、1.95%、1.32%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的小兒感冒寧糖漿樣品（批號：20200410）共6份，每份約3 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定并計算回收率。結(jié)果綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均加樣回收率（n=6）在94.86%~101.19%之間；RSD為0.74%~1.88%。表明方法準(zhǔn)確度良好。（見表2）

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.4 相對校正因子（fm/s）的確定 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)物，計算綠原酸、梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的fm/s。計算公式fm/s=fm/fs=（CmAs）/（CsAm），公式中Cm為待測組分含量，Am為待測組分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物含量，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積。（見表3）

表3 8 種組分的相對校正因子

2.5 耐用性試驗(yàn)

2.5.1 不同儀器、色譜柱對fm/s的影響 精密吸取“2.2.1“項下混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別采用不同品牌儀器和色譜柱進(jìn)行測定，考察2臺高效液相色譜儀（Thermo U3000，島津LC-20A）和3個品牌色譜柱（Waters XSelect HSS T3 C18、Thermo AcclaimTM120 C18、SVEATM A585V3 C18）分別對fm/s值的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同儀器及色譜柱對fm/s 的影響

2.5.2 不同柱溫對fm/s的影響 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別采用不同柱溫進(jìn)行測定，考察柱溫24、26、28、30、32 ℃對fm/s值的影響，結(jié)果表明柱溫對各成分fm/s均無明顯影響。（見表5）

表5 不同柱溫對fm/s的影響

2.5.3 不同流速對fm/s的影響 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別采用不同流速進(jìn)行測定，考察流速0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min對fm/s的影響，結(jié)果表明流速對各組分fm/s值均無明顯影響。（見表6）

表6 不同流速對fm/s的影響

2.5.4 色譜峰的定位 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，對不同儀器和色譜柱進(jìn)行相對保留時間的考察，結(jié)果表明不同儀器和色譜柱的相對保留時間無顯著差異（RSD＜2%）。（見表7）

表7 不同儀器和色譜柱的相對保留時間

2.6 一測多評法和外標(biāo)兩點(diǎn)法測定結(jié)果比較 取不同廠家生產(chǎn)的4批樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，分別使用外標(biāo)法和一測多評法計算各組分含量。結(jié)果表明，兩種方法所得各組分含量無明顯差異（RSD＜2%）。（見表8）

表8 8 種成分ESM 和QAMS 測定結(jié)果 （mg/g）

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)測定的8種組分最大吸收波長均不相同，為保證各組分均有合適的靈敏度和精密度[4]，對供試品溶液和對照品溶液用二極管陣列檢測器在210~440 nm進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)227 nm處梔子苷、牛蒡苷、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素8種成分均有吸收，且有較好的色譜參數(shù)；而綠原酸則存在較大差異，在327 nm處有最大吸收。故確定檢測波長為227 nm、327 nm。

本試驗(yàn)分別考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等不同流動相系統(tǒng)[5-8]，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液時8種組分的分離度均大于1.5。本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同的柱溫（24、26、28、30、32℃）、不同的流速（0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）下各組分的分離效果，發(fā)現(xiàn)在30 ℃、1.0 mL/min時，各組分色譜峰分離效果和峰型較好。本實(shí)驗(yàn)分別考察了2個不同品牌儀器（Thermo U3000、島津LC-20A）、3個不同品牌的色譜柱（Waters XSelect HSS T3 C18、Thermo AcclaimTM120 C18、SVEATM A585V3 C18），發(fā)現(xiàn)上述儀器、色譜柱均能達(dá)到良好的分離效果和重現(xiàn)性。

3.2 供試品溶液提取方法選擇 本試驗(yàn)分別使用甲醇、70%甲醇、95%乙醇、70%乙醇對供試品進(jìn)行提取[9-12]，結(jié)果表明70%甲醇對8種組分提取效率最佳。本實(shí)驗(yàn)分別采用不同提取時間（30、45、60 min）和不同提取方法（超聲、回流）[13-18]對供試品溶液進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)超聲30 min時各組分提取效率最高，故最終確定70%甲醇超聲提取30 min作為供試品的提取方法。

4 小 結(jié)

小兒感冒寧糖漿中金銀花清熱解毒，疏散風(fēng)熱；連翹清熱解毒，消腫散結(jié)，兩者合為君藥。牛蒡子疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽，為臣藥。黃芩清熱燥濕，瀉火解毒；梔子瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒，二者合為佐藥。諸藥合用有疏散風(fēng)熱、清熱止咳的功效[19]。本試驗(yàn)參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則[20-22]，兼顧“君、臣、佐”藥的代表性物質(zhì)，選取穩(wěn)定性好，價格低廉的黃芩苷作為內(nèi)標(biāo)物，同時測定綠原酸、梔子苷、連翹苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量，以多指標(biāo)成分的角度為小兒感冒寧糖漿的質(zhì)量控制提供參考。