李 鶴，龔來覲，陳冬平，楊 琴

（江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，江西 樟樹 331200）

穿王消炎片為中藥復(fù)方制劑，源于《國家中成藥標準匯編》，由穿心蓮、了哥王兩味中藥組成，具有消炎、解毒功效，用于痰熱咳喘、腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性腸胃炎、急性菌痢見以上癥狀者[1]。穿心蓮來源于爵床科屬植物穿心蓮干燥地上部分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、消炎、抗菌等廣泛藥理作用[2-4]。了哥王來源于瑞香科植物了哥王干燥根[5]，具有抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、抗病毒等藥理作用[6-7]，療效確切，但有一定毒副作用。有文獻指出，了哥王有大毒，其果實、莖、葉和根皮均有毒，中毒時可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等消化道反應(yīng)及皮疹等皮膚反應(yīng)[8]。

以往文獻中穿心蓮和了哥王大部分以乙醇為溶劑采用超聲、滲漉、回流等方法提取[9-10]，兩味藥材的提取方法及提取工藝參數(shù)如乙醇的濃度、用量等均不同[11-12]。因此傳統(tǒng)工藝中將穿心蓮和了哥王分別提取，再合并濃縮制成稠膏[13-15]，且尚未考慮了哥王毒性對用藥安全的影響，同時未對提取成分的抗炎藥效和毒性進行藥效學(xué)驗證。

了哥王的炮制減毒方法為“汗?jié)n法”[16-17]，故本研究模擬汗?jié)n減毒的方法采用人工汗液與乙醇的混合溶劑進行提取，達到減毒增效的作用。為便于工業(yè)大生產(chǎn)的推廣，本研究選擇加熱回流的方法同時提取兩味藥材，以簡化生產(chǎn)工藝流程。結(jié)合單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，綜合評價穿王消炎片抗炎療效、肝毒性和浸膏收率。全面考察穿心蓮和了哥王提取的影響因素，以期獲得最佳的穿王消炎片提取方法和生產(chǎn)工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wister大鼠168只，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。大鼠于室內(nèi)保持12 h光照，12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，給予標準飼料和飲用水，且控制室內(nèi)溫度為（25±1）℃，相對濕度在（50±10）%。本實驗方案經(jīng)過江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院實驗動物倫理審查委員會審核，符合實驗動物倫理學(xué)規(guī)定，審查編號：JNDL-20210910。

1.2 藥物及試劑 穿心蓮、了哥王藥材均購于江西樟樹藥材交流中心，經(jīng)龔福保教授鑒定，穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees的干燥地上部分，了哥王為瑞香科蕘花屬植物了哥王Wikstroemia indica (Linn.) C.A. Mey的干燥根。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測試劑盒（批號：20200610）購于南京建成生物工程研究所；人工汗液：含L-組氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、氯化鈉5 g/L、二水合磷酸二氫鈉2.2 g/L，用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，即得；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 CP213型電子天平（美國奧豪斯）；MIKRO 220R型低溫高速離心機（德國Hettich公司）；ADVIA 1800型全自動生化分析儀（德國Siemens Healthcare Diagnostics公司）。

2 方 法

2.1 提取 根據(jù)穿王消炎片處方，取60 g穿心蓮和40 g了哥王粉碎成粗粉，加8倍量30%的人工汗液乙醇溶液（V人工汗液∶V乙醇=30∶70），于60 ℃加熱提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾，濃縮成稠膏狀，干燥至恒重，得穿王干膏。稱重，計算浸膏收率。

2.2 分組與給藥 取雄性Wistar大鼠168只，按體質(zhì)量隨機分組，包括：40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃試驗組，10%、20%、30%、40%、50%試驗組，響應(yīng)面1～17試驗組及模型組，每組6只。各試驗組大鼠分別灌胃穿王干膏[用1.0%羧甲基纖維素鈉（CMC）配制成混懸液]，給藥劑量均為2.2 g/kg；模型組大鼠灌胃給予等體積1.0% CMC蒸餾水混懸液；大鼠灌胃的體積均為20 mL/kg，1次/d，連續(xù)給藥1周。給藥期間正常供給飼料與水。

2.3 抗炎效果測定 采用角叉菜膠致大鼠足跖炎癥模型。末次給藥前，用記號筆在每只大鼠的右后肢踝關(guān)節(jié)周圍做上記號，用容積法測定足容積為致炎前足容積，然后各組大鼠再灌胃給藥，1 h后將1%角叉菜膠0.1 mL注入大鼠右后足跖腱膜下致炎，致炎3 h后再次測定足容積為致炎后足容積，以致炎前、后足容積之差（即腫脹度）為指標，計算每只大鼠的足腫脹抑制率。足腫脹抑制率=（模型組腫脹度-試驗組腫脹度）/模型組腫脹度。

2.4 肝毒性測定 采用肝功能生化指標AST測定法。“2.3”項下大鼠腹主動脈取血，血液靜置40 min，12 000 r/min離心15 min，分離血清，于-20 ℃保存，用全自動生化分析儀測定血清AST水平。

2.5 單因素試驗 前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，提取溫度對足腫脹抑制率、AST值、浸膏收率3個指標中的足腫脹抑制率影響明顯，人工汗液乙醇溶液用量對浸膏收率影響顯著，人工汗液乙醇濃度對足腫脹抑制率及AST值影響顯著，因此單因素試驗中以足腫脹抑制率為指標考察適宜提取溫度，以浸膏收率為指標考察適宜人工汗液乙醇溶液用量，以足腫脹抑制率和AST值為指標考察適宜人工汗液乙醇濃度。故單因素試驗的篩選條件設(shè)為：（1）提取溫度分別在40、50、60、70、80 ℃下，按“2.1”項下方法提取，其他條件不變，測定浸膏的抗炎效果，初步確定合適的提取溫度。（2）人工汗液乙醇溶液用量分別用4、6、8、10、12倍量，按“2.1”項下方法提取，其他條件不變，計算浸膏收率，初步確定合適的人工汗液乙醇溶液用量。（3）分別采用10%、20%、30%、40%、50%人工汗液乙醇，按“2.1”項下方法提取，其他條件不變，測定浸膏的抗炎效果和肝功能指標，初步確定合適的人工汗液乙醇濃度。

2.6 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 13.0軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計。以提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液配比（X3）為響應(yīng)面設(shè)計因素，大鼠足腫脹抑制率（Y1）、肝功能生化指標（Y2）、浸膏收率（Y3）的綜合評分（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)用三因素三水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，優(yōu)化穿王消炎片的提取條件[18]。其中Y以Y1、Y2、Y3的總評“歸一值”計算，根據(jù)3個指標對穿王消炎片提取影響的重要性，設(shè)定各自權(quán)重分別為0.5、0.3、0.2，Y=（Y1/Y1max）×50%+（100+Y2min-Y2）×30%+（Y3/Y3max）×20%，式中Y2越小越好，將各試驗組中Y2min定為100分，其余各組按100+Y2min-Y2計算分數(shù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，穿王消炎片提取物各試驗組分別與模型組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 提取溫度 隨著溫度升高，抗炎效果呈上升趨勢，其中60 ℃試驗組大鼠足腫脹度最小，提示抗炎效果最佳；當(dāng)提取溫度超過60 ℃時，大鼠足腫脹度變大，其抗炎效果下降。由此可知，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高其有效組分的溶出增大，抗炎效果也增加；但溫度過高，其抗炎有效成分會被破壞，使其抗炎效果下降。故選取50、60、70 ℃提取溫度進行下一步試驗。（見表1）

表1 提取溫度對抗炎效果的影響 （±s）

表1 提取溫度對抗炎效果的影響 （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 n 腫脹度/mL 腫脹抑制率/%模型組 6 0.419±0.153 -40 ℃試驗組 6 0.407±0.168 3.13±1.67images/BZ_31_317_787_318_788.png50 ℃試驗組 6 0.335±0.132 19.32±8.34 60 ℃試驗組 6 0.239±0.081a 42.13±14.92 70 ℃試驗組 6 0.286±0.116a 30.46±11.68 80 ℃試驗組 6 0.382±0.141 9.05±4.25

3.1.2 人工汗液乙醇溶液用量 隨著人工汗液乙醇溶液用量的增加浸膏收率也呈增加趨勢，但在人工汗液乙醇溶液用量到8倍用量后，再增加其用量，浸膏收率變化不大，故選取6、8、10倍量人工汗液乙醇溶液進行下一步試驗。（見表2）

表2 人工汗液乙醇用量對浸膏收率的影響

3.1.3 人工汗液乙醇濃度 與模型組比較，10%、20%人工汗液乙醇組大鼠血清AST水平明顯升高（P＜0.05）；30%、40%、50%人工汗液乙醇組大鼠血清AST水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，10%、20%、30%人工汗液乙醇組大鼠足腫脹度明顯減?。≒＜0.05）；40%、50%人工汗液乙醇組大鼠足腫脹度與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。故選取20%、30%、40%人工汗液乙醇溶濃度進行下一步試驗。（見表3）

表3 人工汗液乙醇濃度對毒性和抗炎效果的影響 （±s）

表3 人工汗液乙醇濃度對毒性和抗炎效果的影響 （±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

組別 n AST/（U/L） 腫脹度/mL 腫脹抑制率/%模型組 6 125.42±17.83 0.419±0.153 -10%人工汗液乙醇組 6 209.52±25.37a 0.227±0.068a 44.93±15.7 20%人工汗液乙醇組 6 173.15±23.48a 0.205±0.064a 49.38±16.24 30%人工汗液乙醇組 6 122.74±16.87 0.242±0.072a 41.87±13.65 40%人工汗液乙醇組 6 127.89±19.54 0.353±0.140 14.85±6.49 50%人工汗液乙醇組 6 124.63±18.05 0.395±0.174 5.97±2.86

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化穿王消炎片的提取工藝條件

3.2.1 模型建立與顯著性檢驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果及Box-Benhken試驗設(shè)計原理，對提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液（X3）3個因素設(shè)計的3個編碼水平見表4。按響應(yīng)面1～17試驗組條件進行試驗，測大鼠足腫脹抑制率（Y1）、肝功能生化指標（Y2）、浸膏收率（Y3）3個指標，計算綜合評分（Y），結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)曲面因素及水平編碼值表

表5 響應(yīng)曲面因素及水平編碼值表

對表5進行多元回歸擬合，得自變量提取溫度（X1）、人工汗液乙醇溶液用量（X2）、人工汗液乙醇溶液濃度（X3）與因變量綜合評分（Y）之間的線性回歸方程為Y=87.56+6.63X1+2.36X2-2.43X3-1.12X1X2-3.17X1X3-3.09X2X3-13.17X12-4.81X22-6.68X32。

回歸模型方差分析結(jié)果見表6。模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項P=0.186 1＞0.05，模型失擬項不顯著，說明殘差是由隨機因素引起，回歸方程擬合度和可信度較高，使用該方程模擬實際的三因素三水平分析可行。決定系數(shù)R2=0.984 5＞0.95，說明此模型擬合度很高，與實際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；校正決定系數(shù)Radj2=0.964 6，說明此模型可解釋96.46%數(shù)據(jù)變異性。各因素之間存在著一定交互作用，X1、X3、X12、X22、X32為極顯著項（P＜0.01），X2、X1X3、X2X3為顯著項（P＜0.05），而X1X2對綜合評分影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可判斷，3個因素對綜合評分的影響順序為X1＞X3＞X2。

3.2.2 提取工藝響應(yīng)面分析及優(yōu)化 根據(jù)顯著性分析繪制響應(yīng)面圖，由等高線可得，X1X3、X2X3交互作用顯著（等高線呈橢圓形），X1X2交互作用不顯著（等高線呈圓形）。由響應(yīng)面可知，提取溫度和人工汗液乙醇溶液濃度對綜合評分有顯著影響，表現(xiàn)為響應(yīng)面陡峭，而人工汗液乙醇溶液用量的響應(yīng)面較為平緩，對綜合評分的影響不顯著。（見圖1～3）

圖1 因素X1 和X2 對穿王消炎片提取工藝的影響

圖2 因素X1 和X3 對穿王消炎片提取工藝的影響

圖3 因素X2 和X3 對穿王消炎片提取工藝的影響

3.2.3 提取工藝驗證 利用Design-Expert的Numerical分析得最佳提取工藝條件：提取溫度為62.76 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.63倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為26.8%，在此條件下的綜合評分為89.24。為驗證響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，結(jié)合實際操作方便，將工藝參數(shù)進行調(diào)整優(yōu)化：提取溫度為63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.5倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為27%，在此條件下進行3組平行試驗，結(jié)果綜合評分的均值為89.12，與回歸模型預(yù)測值有良好的吻合性，說明模型可靠，可用于穿王消炎片的提取。

4 討 論

穿王消炎片其功效主要是消炎解毒。臨床可用于痰熱咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃體炎、咽喉炎、肺炎、急性腸胃炎和急性菌痢等炎癥。其作為“綠色消炎藥”具有廣闊的市場前景，但目前提取方法大都將兩味藥分別提取，生產(chǎn)工序既繁瑣復(fù)雜，且不符合中醫(yī)整體煎煮的用藥思想。故對其提取工藝進一步研究。

當(dāng)前兩者的提取工藝大都采用測定提取物中某類有效成分的含量，如對穿心蓮內(nèi)酯、總黃酮等進行評價[9-11]。此評價方法不能反映提取物中所有成分的藥效，因此本試驗以藥效學(xué)指標進行評價，可反映提取工藝的真實效果。本試驗嘗試用乙醇合并提取，并找出最適濃度，同時考慮到了哥王毒性，模擬“汗?jié)n法”采取人工汗液和乙醇作為混合溶劑提取其有效成分，降低毒性。本試驗提取方法改變了以往對穿心蓮和了哥王的提取均采用不同濃度的乙醇或甲醇分別提取的方法[12-15]。同時本研究使用造角叉菜膠致大鼠足跖炎癥模型，以大鼠足腫脹抑制率為藥效評價指標，全面評價提取物的抗炎效果。

肝臟是藥物代謝的主要器官，藥物肝毒性一直是藥物安全性評價的重點之一。AST是反映肝細胞損傷的重要指標，符合本試驗評價藥物毒性的指標。鑒于生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，本研究選取浸膏收率為提取完全的評價指標。故本研究以足腫脹抑制率、AST值、浸膏收率為綜合評價指標，全面評價穿王消炎片的提取工藝，以期較全面反映提取工藝的合理性。

單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗中大鼠足腫脹抑制率結(jié)果顯示，提取溫度在60 ℃左右、人工汗液乙醇溶液濃度在低于30%時提取物的抗炎效果較好，可能有以下兩方面原因：一是提取溫度過低則有效成分溶出不完全，而提取溫度過高，導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯水解；二是人工汗液乙醇溶液濃度過高，使乙醇含量少致有效成分溶出少。由AST值可知，人工汗液乙醇溶液濃度在30%以上時，其肝毒性較小，而低于30%時肝毒性較大，說明用人工汗液提取能降低了哥王的毒性。由浸膏收率可知，人工汗液乙醇溶液用量到8倍量以上時，其浸膏收率的增加不明顯，低于8倍量則提取不完全。

本試驗采用響應(yīng)曲面法對穿心蓮與了哥王合并提取，進一步優(yōu)化工藝程序。對提取溫度、人工汗液乙醇溶液用量、人工汗液乙醇溶液濃度3個因素各水平進行分析，發(fā)現(xiàn)提取溫度和人工汗液乙醇溶液用量兩者的交互作用對綜合評分有顯著影響，反映了因素間的交互作用，并以較少試驗次數(shù)對因素間的非線性關(guān)系進行研究，克服了正交試驗只能對試驗點進行分析而不能給出整個區(qū)域最優(yōu)值，精度不高的缺點。本研究通過響應(yīng)曲面法建立了穿心蓮與了哥王合并提取工藝的二次多項式數(shù)學(xué)模型，得出了最佳提取工藝條件：提取溫度為63 ℃，人工汗液乙醇溶液用量為8.5倍量，人工汗液乙醇溶液濃度為27%（V人工汗液∶V乙醇=27∶73）。在此條件下進行工藝驗證，結(jié)果驗證值與回歸模型預(yù)測值有良好的吻合性，模型擬合程度高，試驗誤差小。

綜上，本試驗采用的提取工藝使提取物抗炎藥效高、毒性低和副作用小，可為工業(yè)生產(chǎn)和臨床用藥提供參考。