張 寧，郭亞麗，彭艷茹，王玉光

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一類慢性、進(jìn)行性加重的纖維化性間質(zhì)性肺疾病，普通型間質(zhì)性肺炎是其典型的組織病理學(xué)表現(xiàn)。IPF以慢性咳嗽、漸進(jìn)性呼吸困難或活動(dòng)后氣喘等為主要臨床表現(xiàn)[1]。IPF病因及發(fā)病機(jī)制未明，多種促炎及促纖維化因子參與本病的發(fā)生發(fā)展；其中持續(xù)性肌成纖維細(xì)胞表型可引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和肺組織的異常修復(fù)，最終可導(dǎo)致肺組織瘢痕形成、肺泡結(jié)構(gòu)扭曲和肺功能不可逆轉(zhuǎn)的喪失[2]。相關(guān)報(bào)道顯示[3]，在體檢人群中IPF的檢出率約為5.52%，而且男性的患病率高于女性。IPF目前仍缺乏有效的治療藥物，雖然抗纖維化藥物吡非尼酮、尼達(dá)尼布可延緩疾病的進(jìn)展，但不能改善患者咳嗽、喘息、疲乏等臨床癥狀，同時(shí)存在一定的不良反應(yīng)，如惡心嘔吐等胃腸道癥狀、皮膚光過敏、肝功能異常等，使部分患者難以接受[4]。

從中醫(yī)學(xué)來講，IPF屬于“肺痿”等范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，其中肺腎虧虛是IPF的發(fā)病基礎(chǔ)[5]。因本病的病位、病機(jī)及臨床癥狀均與腎關(guān)系密切，故現(xiàn)代醫(yī)家學(xué)者在治療IPF時(shí)，強(qiáng)調(diào)從腎論治[6-7]。Mate分析結(jié)果顯示，應(yīng)用補(bǔ)腎法治療間質(zhì)性肺疾病可改善患者咳嗽、喘息等臨床癥狀，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)，安全性可靠[8]。本課題組自擬熟地鎖陽方治療IPF，前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)該方可改善患者咳嗽、疲乏無力等癥狀，但其作用機(jī)制尚不明確。中藥復(fù)方具有多種有效成分，同時(shí)其成分也作用于諸多靶點(diǎn)，故其治療疾病的作用機(jī)制十分復(fù)雜。應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬的分子對(duì)接技術(shù)，可以從微觀的分子角度闡釋藥物有效化合成分與疾病靶點(diǎn)的結(jié)合機(jī)制，從而有利于探究中藥復(fù)方干預(yù)疾病的作用機(jī)制，而且在一定程度上縮短了研究周期，降低了研究費(fèi)用[9-10]。故本研究擬采用分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，將熟地鎖陽方中有效化合物和疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行模擬對(duì)接，并通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而對(duì)熟地鎖陽方治療IPF的療效及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 有效化合物與靶點(diǎn)篩選及分子對(duì)接

1.1.1 熟地鎖陽方中有效化合物的收集與篩選 應(yīng)用TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫收集熟地鎖陽方的有效化合物。應(yīng)用Cytoscape 3.8.0中的CytoNCA軟件，通過Degree進(jìn)行評(píng)分，由高到低排序后，選取Degree較高的有效化合物作為小分子配體，進(jìn)行后續(xù)的分子對(duì)接。

1.1.2 “藥物-疾病”潛在作用靶點(diǎn)的選取 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)查找熟地鎖陽方中化合物所作用的靶點(diǎn)。以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關(guān)鍵詞，分別從GeneCards、PharmGkb、OMIM、DrugBank及TTD數(shù)據(jù)庫對(duì)IPF潛在致病靶點(diǎn)基因進(jìn)行搜索。各個(gè)數(shù)據(jù)庫結(jié)果取并集，同時(shí)刪除重復(fù)的靶基因。

將藥物作用靶點(diǎn)與疾病作用靶點(diǎn)取交集后，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。然后將PPI網(wǎng)絡(luò)圖相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，利用此軟件中CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治?，從而?duì)靶點(diǎn)進(jìn)一步篩選，獲得核心作用靶點(diǎn)。主要依據(jù)中間值（BC）、貼近度中心度（CC）、度中心度（DC）、特征向量中心度（EC）、局部平均連接基方法（LAC）和網(wǎng)絡(luò)中心度（NC）來篩選核心靶點(diǎn)，這些值大于或等于中值[11]。結(jié)合所獲得的核心作用靶點(diǎn)及相關(guān)文獻(xiàn)，選取相關(guān)的靶點(diǎn)作為大分子受體，進(jìn)行分子對(duì)接。

1.1.3 分子對(duì)接預(yù)測(cè)熟地鎖陽方干預(yù)IPF的可能作用靶點(diǎn) 從PubChem數(shù)據(jù)庫下載熟地鎖陽方潛在活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，通過應(yīng)用ChemOffice軟件將其2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)基因的大分子蛋白受體，Pymol軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)中的水分子及小分子配體，并導(dǎo)入AutoDock－Tools進(jìn)行加氫等預(yù)處理。應(yīng)用Vina軟件對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，分析其結(jié)合活性。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只，體質(zhì)量22~23 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物房，室溫（24±2）℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替環(huán)境，攝食飲水自由。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理批號(hào)：BJTCM-M-2021-05-02。

1.2.2 藥物與試劑 熟地鎖陽方，方藥組成：熟地黃30 g，鎖陽20 g，山萸肉20 g，牛膝30 g，人參20 g，麥冬20 g，當(dāng)歸10 g，五味子10 g。熟地黃（批號(hào)：21040101）、鎖陽（批號(hào)：20210204）、山萸肉（批號(hào)：21011101）、牛膝（批號(hào)：21031401）、人參（批號(hào)：20210912）、麥冬（批號(hào)：200409）、當(dāng)歸（批號(hào)：21082601）、五味子（批號(hào)：21051504）均購自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院王玉光教授鑒定為正品；上述中藥飲片在煎煮之前用去離子水浸泡60 min，煎煮2次，將2次煎煮的藥液合并，每劑中藥濃縮至生藥濃度約為2.4 g/mL。注射用鹽酸博來霉素（批號(hào)：H20055883，規(guī)格：1.5萬單位/支）購自浙江翰輝制藥有限公司；4%多聚甲醛（批號(hào)：BL539A）購自北京蘭杰柯科技有限公司；無水乙醇（批號(hào)：100092683）、二甲苯（批號(hào)：10023418）、中性樹膠（批號(hào)：10004160）均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒（批號(hào)：12183018A）購自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；一步法熒光定量RT-PCR試劑盒（096A）（批號(hào)：PK0445）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；小鼠GAPDH內(nèi)參引物（批號(hào)：B661304-0001）及VEGFA、EGFR引物合成均來自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Anti-α-SMA一抗（批號(hào)：19245T）購自美國(guó)Cell Signaling Technology；Anti-GAPDH一抗（批號(hào)：60004-1-1g）購自武漢Proteintech公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)：A0208g）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 主要儀器 JJ-12J型脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康儀器有限公司）；Tissuelyser-24型全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；LightCycler 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀（德國(guó)羅氏公司）；BIO-RAD Gel DocTM XR+型化學(xué)發(fā)光儀（美國(guó)Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室有限公司）；Centrifuge 5424 R小型離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；EMMS eSpira Forced Maneuvers型小鼠肺功能儀（英國(guó)EMMS公司）。

1.2.4 分組與造模 30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，逐個(gè)稱量體質(zhì)量，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、熟地鎖陽方組，每組10只。目前指南中公認(rèn)的治療IPF的藥物為吡非尼酮、尼達(dá)尼布，既往研究中并未找到確切的證據(jù)證明上述兩種藥物對(duì)本研究所驗(yàn)證的靶點(diǎn)（VEGFA、EGFR）具有調(diào)控作用，故本研究并未設(shè)置陽性藥物組。使用單次氣管內(nèi)滴注博來霉素的方法造模[12]，模型組和熟地鎖陽方組小鼠單次氣管內(nèi)滴注博來霉素（5 IU/kg）至氣管，對(duì)照組小鼠滴注等體積的生理鹽水至氣管。肺纖維化小鼠模型制備成功評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[12]：HE染色結(jié)果顯示小鼠正常肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，炎癥細(xì)胞滲出，肺泡間質(zhì)增寬；Masson染色結(jié)果顯示可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)給藥 參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，于模型制備成功后第8天開始給予熟地鎖陽方干預(yù)。根據(jù)2001年版《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[14]計(jì)算臨床等效劑量為熟地鎖陽方組小鼠的給藥劑量，即熟地鎖陽方組小鼠灌胃給予熟地鎖陽方藥液，0.24 g/10 g；對(duì)照組及模型組小鼠給予等體積的去離子水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.2.6 觀察指標(biāo)

1.2.6.1 小鼠肺功能 給藥結(jié)束后，小鼠行氣管插管術(shù)，應(yīng)用EMMS eSpira Forced Maneuvers有創(chuàng)肺功能儀，檢測(cè)小鼠的用力肺活量（FVC）、吸氣能力（IC）。

1.2.6.2 小鼠肺系數(shù) 收集小鼠的肺組織，用紗布擦拭干凈，稱重，計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)（Lung index）=肺濕質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g）。

1.2.6.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 將分離的新鮮左肺組織在4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）、脫蠟，分別運(yùn)用HE和Masson的三色試劑盒染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的炎癥與纖維化情況。

1.2.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量 稱取小鼠右肺組織適量，加入1×磷酸鹽平衡生理鹽水PBS勻漿。然后根據(jù)PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒說明書提取總RNA。依據(jù)一步法熒光定量RT-PCR試劑盒（096A）中的說明書，配置相應(yīng)的體系。在96孔板每孔中加入總RNA 2 μL，同時(shí)加入18 μL的反應(yīng)體系，將96孔板放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行定量檢測(cè)。PCR儀設(shè)置的條件為：45 ℃5 min，95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)。以小鼠GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列：VEGFA，上游引物TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC，下游引物CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA；EGFR，上游引物ACAGAAGGAGTAGATACGCTTG，下游引物GATTATTCGATGATGCTTCCCG。

1.2.6.5 Western blotting法檢測(cè)α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量 將混合蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液加入肺組織勻漿中，裂解以獲得總蛋白；應(yīng)用SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；使用由TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，在4 ℃條件下與兔源Anti-α-SMA（1∶1 000）、Anti-GAPDH（1∶5 000）一抗孵育過夜。與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（1:1 000）二抗室溫?fù)u床孵育2 h后，將化學(xué)發(fā)光顯色劑滴加于PVDF膜上，運(yùn)用化學(xué)發(fā)光儀對(duì)免疫印跡進(jìn)行可視化。GAPDH被用作負(fù)荷對(duì)照。所有值均根據(jù)GAPDH蛋白水平的條帶強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0軟件和SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熟地鎖陽方中有效化合物篩選 通過TCMSP與BATMANTCM數(shù)據(jù)庫收集熟地鎖陽方的有效化合物，共獲得115個(gè)有效化合物，然后根據(jù)Degree進(jìn)行評(píng)分后，由高到低進(jìn)行排序，選取Degree≥110的化合物作為小分子配體，共5個(gè)。（見表1）

表1 熟地鎖陽方有效成分信息表（Degree≥110）

2.2 “藥物-疾病”潛在作用靶點(diǎn) 共獲得藥物、疾病的潛在作用靶點(diǎn)分別為847、837個(gè)，得到163個(gè)“藥物-疾病”潛在作用靶點(diǎn)。將“藥物-疾病”潛在作用靶點(diǎn)運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治龊螅Y選得到的核心靶點(diǎn)為VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53、AKTI、MAPK14、TNF、FOS、JUN。（見圖1）

圖1 核心作用靶點(diǎn)篩選

2.3 分子對(duì)接結(jié)果 為預(yù)測(cè)熟地鎖陽方治療IPF可能的潛在作用靶點(diǎn)，選取熟地鎖陽方中Degree≥110的化合物作為小分子配體，包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，本研究選取VEGFA、EGFR為大分子受體，應(yīng)用AutoDock_Vina進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)結(jié)合能結(jié)果，預(yù)測(cè)大分子受體與小分子配體的結(jié)合活性及對(duì)接是否良好。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示[18]：若結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol則表示具有明顯結(jié)合活性，若結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol則表示結(jié)合活性較好，若結(jié)合能＜-4.0 kcal/mol則表示有一定的結(jié)合活性。本研究結(jié)果顯示，VEGFA、EGFR與上述5種化合物均存在結(jié)合活性，≤5.0 kcal/mol者占總數(shù)70%，≤-7.0 kcal/mol者占總數(shù)60%，則表示絕大部分靶點(diǎn)和成分的結(jié)合活性較強(qiáng)。（見表2、圖2）

圖2 分子對(duì)接模擬圖（部分）

表2 熟地鎖陽方有效化合物與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

2.4 各組小鼠FVC、IC、肺系數(shù)及肺組織中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠FVC、IC均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠FVC、IC均明顯升高（P＜0.01），提示熟地鎖陽方可明顯改善肺纖維化小鼠的肺功能。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)及肺組織中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺系數(shù)及肺組織中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組小鼠FVC、IC、肺系數(shù)及肺組織中α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變情況 HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及結(jié)締組織增生；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡融合塌陷、結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間質(zhì)增寬，同時(shí)也有不同程度炎癥細(xì)胞滲出；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織上述病理變化均有不同程度的好轉(zhuǎn)，肺泡融合塌陷較少，肺組織結(jié)構(gòu)較完整，病變范圍局限，炎性滲出物減少。（見圖4）

圖4 各組小鼠肺組織病理切片圖 （×200）

Masson染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，未見明顯的藍(lán)色膠原纖維沉積；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡融合塌陷、結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織藍(lán)色膠原纖維的沉積減少。（見圖4）

2.6 各組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，熟地鎖陽方組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。（見圖5）

圖5 各組小鼠肺組織中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=6）

3 討 論

IPF是一種慢性、進(jìn)展性間質(zhì)性肺疾病，其特征是纖維化組織在肺實(shí)質(zhì)中進(jìn)行性異常積聚[19]。雖然抗纖維化藥物（吡非尼酮、尼達(dá)尼布）應(yīng)用于臨床使IPF的治療取得了突破性進(jìn)展，但因其費(fèi)用較昂貴、部分患者不耐受等，需積極探索與開發(fā)新的治療藥物。本病因氣虛而起，雖與肺、脾、腎等臟均相關(guān)，但其重點(diǎn)仍在于腎精虧虛，故其病機(jī)與肺腎虧虛、攝納失司有關(guān)，治予熟地鎖陽方。熟地鎖陽方是由《景岳全書》中的貞元飲及《辨證錄》中的定喘神奇丹加減而成。方中熟地黃、山萸肉滋腎陰，益精髓；鎖陽以陽中求陰，以達(dá)補(bǔ)陰及益精血之目的；人參益肺腎之元?dú)?，與熟地黃合用，以陰中求陽，生精生血；麥冬甘寒養(yǎng)陰，入肺經(jīng)，以養(yǎng)肺陰；牛膝既引血下行，又補(bǔ)其下元之氣，以補(bǔ)益腎精；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，使補(bǔ)而不滯，并防熟地黃之膩；五味子味酸收斂，甘溫而潤(rùn)，能上斂肺氣，下滋腎陰；全方溫?cái)坎⒂?，補(bǔ)中有降，共奏補(bǔ)腎益肺、填精納氣、調(diào)補(bǔ)陰陽之功。

本研究預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，熟地鎖陽方主要化合成分包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）等。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[20]，單羥基十四烷酸異構(gòu)體具有抗脲酶、抗磷酸酶和抗氧化活性，而IPF的發(fā)病機(jī)制包括氧化應(yīng)激反應(yīng)及TGF-β、PI3K/Akt等信號(hào)通路中相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)生磷酸化使信號(hào)通路激活，促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等，故十四烷酸可能是治療IPF的一個(gè)潛在化合物[21]。BHAGAT M等[22]研究顯示，雪松樹皮揮發(fā)油中主要成分9-十八烯酸等化合物與NF-κB具有顯著的結(jié)合親和力，可使結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平降低。而NF-κB在IPF發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，NF-κB激活后可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。由此可知，9-十八烯酸可能會(huì)通過調(diào)控NF-κB表達(dá)而改善肺纖維化程度[23]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抑制炎癥反應(yīng)、改善氧化與抗氧化系統(tǒng)功能、調(diào)控TGF-β1表達(dá)、調(diào)節(jié)成纖維化細(xì)胞凋亡與增殖等作用，是治療IPF的一個(gè)重要化合物[24]。張興彩等[25]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著降低FN、α-SMA、Collagen I等肺纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，通過調(diào)控S1P/SphK1信號(hào)通路而發(fā)揮其改善小鼠肺組織纖維化程度的作用。豆甾醇具有較強(qiáng)的表面活性與生理活性，其主要作用包括抗炎、抗氧化及抗腫瘤等[26]。山奈酚屬于黃酮類化合物中的一種，具有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用[27]。GONG J H等[28]研究顯示，山奈酚可逆轉(zhuǎn)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，降低N-鈣黏蛋白及α-SMA表達(dá)水平，顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，減少小鼠肺組織膠原沉積，減輕纖維化氣道重塑。因此，篩選出的有效化合物很有可能是熟地鎖陽方治療IPF的關(guān)鍵化合物。

本研究共篩選得到VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53等9個(gè)核心作用靶點(diǎn)。IPF的纖維化機(jī)制仍不明確，與異常修復(fù)、膠原纖維大量沉積和血管重塑發(fā)展相關(guān)[29]。多種信號(hào)通路參與IPF的發(fā)生發(fā)展，如TGFβ、PI3K/AKT及VEGF信號(hào)通路等[30-31]。VAGFA為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A，可影響肺泡Ⅱ型細(xì)胞生長(zhǎng)、表面活性劑的產(chǎn)生及血管的生成，在肺損傷后修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[32]。相關(guān)報(bào)道[33]顯示，IPF患者外周血中VEGFA表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展相關(guān)。相關(guān)的基礎(chǔ)研究[34]也證明，在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中VEGFA的表達(dá)水平顯著升高。BARRATT S L等[35]研究顯示，VEGFA可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)，是肺纖維化的驅(qū)動(dòng)因素。EGFR即表皮生長(zhǎng)因子受體其參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，可能是通過上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的EGFR通路依賴性旁分泌環(huán)發(fā)生的。EGFR可導(dǎo)致過度的膠原生成和沉積[36]。ISHII Y等[37]研究顯示，抑制EGFR可緩解BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化程度。由此可知，VEGFA、EGFR在IPF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能是治療IPF的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，VEGFA、EGFR與所篩選的關(guān)鍵的5種化合物均存在結(jié)合活性，且絕大部分靶點(diǎn)和成分的結(jié)合活性較強(qiáng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熟地鎖陽方可改善肺纖維化小鼠的肺功能，降低肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、改善肺結(jié)構(gòu)及減少膠原纖維的沉積，降低肺系數(shù)，并可明顯降低肺組織中α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量及VEGFA mRNA、EGFR mRNA相對(duì)表達(dá)量。本研究表明熟地鎖陽方對(duì)IPF具有治療作用，VEGFA、EGFR可能是熟地鎖陽方干預(yù)IPF的重要作用機(jī)制與關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究為臨床應(yīng)用熟地鎖陽方治療IPF提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了一定方向，但其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)深入驗(yàn)證。