李祖攀,谷 江△, 張永春,楊清滔,劉 淼

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,貴州貴陽 550004;2.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院泌尿外科,貴州貴陽 550005

多種機(jī)械或非機(jī)械原因造成的橫紋肌溶解綜合征(RM)有13.0%～50.0%會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷(AKI),其病死率約為59.0%[1-2]。RM導(dǎo)致AKI的機(jī)制包括腎血管收縮、管型形成、肌紅蛋白過氧化損傷、炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[3]。目前,RM導(dǎo)致AKI的治療方法不多,并且經(jīng)典藥物治療預(yù)后較差,血漿置換或血液透析等治療經(jīng)濟(jì)成本高,且只能在醫(yī)院完成治療[4]。因此,研發(fā)RM導(dǎo)致AKI的新型藥物成為當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究表明,Klotho基因在多種病因?qū)е碌腁KI中通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等表現(xiàn)出腎保護(hù)作用,且Klotho基因可拮抗RM導(dǎo)致的AKI[5-6]。黃芩苷具有較強(qiáng)的生物活性,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用,并且可提高Klotho基因表達(dá)后改善糖尿病小鼠模型的AKI[7-8],但目前將黃芩苷用于RM導(dǎo)致AKI的研究較少見。本研究構(gòu)建RM導(dǎo)致AKI的大鼠模型,觀察不同劑量黃芩苷對(duì)大鼠的保護(hù)作用,并探究其可能的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SD雄性大鼠30只作為研究對(duì)象,體質(zhì)量200～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、黃芩苷低劑量干預(yù)組(低劑量組)、黃芩苷中劑量干預(yù)組(中劑量組)和黃芩苷高劑量干預(yù)組(高劑量組),每組6只。常規(guī)鼠餌喂養(yǎng),自由進(jìn)食、進(jìn)水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。

1.2儀器與試劑 721分光光度計(jì)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);7170型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司);CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)儀(美國Bio-Rad公司)。黃芩苷(成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所有限公司);Trizol試劑(賽默飛世爾科技公司);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司);引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備與處理 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及相關(guān)制度要求執(zhí)行。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后禁食、禁水24 h。采用50.0%甘油,按10 mL/kg濃度注射大鼠雙下肢肌肉,建立RM模型。將腎組織病理檢測(cè)和腎功能檢測(cè)結(jié)果作為AKI的判斷標(biāo)準(zhǔn)。各干預(yù)組大鼠于注射甘油前20 min腹腔注射黃芩苷溶液,低、中、高劑量組注射分別為50、100、200 mg/kg。陽性對(duì)照組肌肉注射生理鹽水。陰性對(duì)照組不做任何處理。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于藥物干預(yù)5 h后采用股動(dòng)脈放血法剖殺,收集血液標(biāo)本,左腎多聚甲醛固定待病理檢測(cè),右腎液氮轉(zhuǎn)運(yùn)后于-80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.3.2血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)水平。

1.3.3腎組織病理學(xué)檢查 HE染色:將左腎組織石蠟切片脫蠟后浸入蘇木素染色10 min,經(jīng)1.0%鹽酸乙醇、0.1%氨水處理后,浸入0.5%伊紅染色2 min 。漂洗、脫水、透明后,采用中性樹膠封固。

1.3.4腎組織SOD、MDA水平檢測(cè) 取 1 g 腎組織加入玻璃勻漿管中制成組織勻漿,2 500 r/min離心 10 min,取上清液,采用比色法檢測(cè)SOD、MDA水平。

1.3.5腎臟Klotho基因表達(dá)情況檢測(cè) 大鼠右腎組織研磨后進(jìn)行細(xì)胞裂解,使用Trizol試劑提取總RNA,經(jīng)純度檢測(cè)后,將核酸純度指示值(A260/A280)大于1.8的作為合格樣品通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板單鏈DNA,使用PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)過程。引物序列分別為:Klotho基因正向引物為5′-CAATGGCTTCCCTCCTTTAC-3′,反向引物為5′-AGCACAGGTTTGCGTAGTCT-3′;β-actin基因正向引物為5′-TGACGTGGACAT CCGCAAAG3′,反向引物為5′-CTGGAAGGTGGAC AGCGAGG-3′。反應(yīng)條件為:95 ℃ ,1 min;92 ℃,30 s;60 ℃,30 s;74 ℃,30 s。連續(xù)循環(huán)40次,每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織的病理學(xué)影響 HE染色結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組大鼠腎小管基底膜完整,上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,無炎癥細(xì)胞浸潤。陽性對(duì)照組大鼠可見腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落,腎小管管腔擴(kuò)張,腎間質(zhì)水腫,有較多的炎癥細(xì)胞浸潤。黃芩苷干預(yù)組的腎組織損傷程度與陽性對(duì)照組比較均有所減輕,炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少,且隨著黃芩苷劑量的升高,腎組織損傷程度明顯減輕。見圖1。

注:A為陰性對(duì)照組;B為陽性對(duì)照組;C為低劑量組;D為中劑量組;E為高劑量組。

2.2黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織血清BUN、Cr、CK水平的影響 陽性對(duì)照組血清BUN、Cr、CK水平明顯高于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高劑量組血清BUN、Cr、CK水平均高于陰性對(duì)照組,但明顯低于陽性對(duì)照組,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織血清BUN、Cr、CK水平的影響

2.3黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的影響 陽性對(duì)照組和低、中、高劑量組血清MDA水平均明顯高于陰性對(duì)照組,而血清SOD水平均明顯低于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對(duì)照組比較,血清MDA水平在黃芩苷低、中、高劑量組明顯下降,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清SOD水平在黃芩苷低、中、高劑量組中明顯高于陽性對(duì)照組,且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的影響

2.4黃芩苷對(duì)RM大鼠腎組織Klotho基因表達(dá)的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示,陽性對(duì)照組的Klotho基因的表達(dá)量為(1.16±0.56),明顯低于陰性對(duì)照組的(2.12±0.25),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高劑量組Klotho基因表達(dá)量分別為(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明顯高于陰性對(duì)照組的(2.12±0.25),且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

AKI作為RM的常見并發(fā)癥,病死率高且涉及的病理機(jī)制復(fù)雜,目前相關(guān)治療手段尚待優(yōu)化和提高[4]。因此,研究如何拮抗RM導(dǎo)致的AKI具有一定的臨床意義。當(dāng)前治療RM導(dǎo)致AKI的方法主要為經(jīng)典藥物治療和腎臟替代治療,但其療效不理想,且預(yù)后較差,仍需進(jìn)一步探索RM導(dǎo)致AKI的分子機(jī)制,為研發(fā)新的靶向藥物提供依據(jù)。

黃芩苷是黃芩中重要活性成分之一,是天然的抗氧化劑,具有明顯的抗炎功效[9]。黃芩苷中的黃酮類和多酚類可有效清除活性氧自由基,對(duì)AKI有明顯保護(hù)作用[10]。本研究實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)雙后肢肌肉注射甘油,HE染色觀察腎組織病理學(xué)變化,同時(shí)檢測(cè)血清BUN、Cr、CK水平,構(gòu)建RM導(dǎo)致AKI的大鼠模型。本研究結(jié)果顯示,與陽性對(duì)照組比較,低、中、高劑量組血清BUN、Cr、CK水平均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示黃芩苷可改善大鼠AKI。

Klotho基因編碼的單次跨膜蛋白在診斷AKI敏感性和特異性方面優(yōu)于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,有望成為AKI早期診斷的新型生物標(biāo)志物[11]。有研究證實(shí)Klotho是一種對(duì)AKI有保護(hù)作用的基因,可防御因缺血再灌注、氧化應(yīng)激和RM等所致AKI[5]。在AKI中,腎小管上皮細(xì)胞大量壞死,機(jī)體釋放的Klotho基因可降低血清BUN、Cr水平、抑制AKI標(biāo)志物與促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。上調(diào)Klotho基因還可抑制腎小管上皮細(xì)胞壞死,促進(jìn)腎小管細(xì)胞增殖[12]。既往有研究證實(shí),黃芩苷可提高Klotho基因的表達(dá),進(jìn)而改善動(dòng)物模型的AKI[8]。

RT-qPCR結(jié)果顯示,不同劑量黃芩苷處理RM所致AKI大鼠后, 低、中、高劑量組Klotho基因表達(dá)量分別為(2.43±0.49)、(4.15±0.24)和(5.82±0.36),明顯高于陰性對(duì)照組的(2.12±0.25),且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示黃芩苷可促進(jìn)Klotho基因的表達(dá),且黃芩苷劑量越大,Klotho基因的表達(dá)越高。本次研究還發(fā)現(xiàn),黃芩苷處理RM所致AKI大鼠后,與陽性對(duì)照組比較,黃芩苷干預(yù)組血清MDA水平明顯下降,且高劑量組<中劑量組<低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清SOD水平在黃芩苷低、中、高劑量組明顯高于陽性對(duì)照組,且高劑量組>中劑量組>低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示黃芩苷可減輕氧化應(yīng)激,且劑量越高,氧化應(yīng)激減輕程度越高。

綜上所述,黃芩苷可明顯改善大鼠RM導(dǎo)致的AKI,其機(jī)制可能與促進(jìn)Klotho基因表達(dá)和減輕氧化應(yīng)激相關(guān)。但本研究仍存在局限性,如尚不能明確黃芩苷促進(jìn)Klotho基因表達(dá)和減輕氧化應(yīng)激的具體機(jī)制,因此,黃芩苷的長期作用效應(yīng)還需要進(jìn)行深入研究。