劉慧寧，劉 磊，于 爽，李雪巖，王新宇，祁東盈，潘福璐，柴曉鈺，王倩倩，潘艷麗，劉 洋*

基于UPLC-HRMS的大鼠體內(nèi)梔子多成分序貫代謝研究

劉慧寧1，劉 磊2，于 爽1，李雪巖1，王新宇1，祁東盈1，潘福璐1，柴曉鈺1，王倩倩1，潘艷麗3*，劉 洋1*

1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488 2. 品珍草（北京）生物科技有限公司，北京 100022 3. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700

采用序貫代謝方法結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-HRMS）技術(shù)，鑒定給藥后不同血漿樣品中的原型成分與代謝產(chǎn)物，研究梔子化學成分在大鼠體內(nèi)不同部位的代謝情況。首先制備梔子提取液，然后通過腸灌流和封閉腸環(huán)法分別收集腸壁代謝、腸道菌群代謝、肝代謝的血漿樣品，ig給藥后收集綜合代謝血液樣品，結(jié)合UPLC-HRMS對各個樣品所含成分進行分析與鑒別。從梔子提取液中共檢測到環(huán)烯醚萜苷類、萜類、有機酸類和梔子黃色素類等46個化學成分。序貫代謝研究結(jié)果表明，在腸代謝樣品中檢測到38個原型入血成分和22個代謝產(chǎn)物，肝代謝樣品中檢測到25個原型入血成分和16個代謝產(chǎn)物，綜合代謝組樣品中檢測到14個原型入血成分和10個代謝產(chǎn)物?；谛蜇灤x方法，解析梔子在大鼠體內(nèi)的原型入血成分與代謝產(chǎn)物，不同代謝部位成分的差異為闡明梔子代謝成分在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程提供了依據(jù)。

梔子；多成分序貫代謝；UPLC-HRMS；原型成分；代謝產(chǎn)物；環(huán)烯醚萜苷；梔子苷；梔子新苷

梔子又名山梔子，是茜草科植物梔子Ellis的干燥成熟果實[1]，梔子含環(huán)烯醚萜苷類、單環(huán)單萜類、黃酮類、有機酸酯類等多種化學成分[2-3]，藥理活性廣泛，包括清除自由基、抗氧化[4]、抗炎[5]、降低血糖和調(diào)血脂[6]、保肝利膽[7]、神經(jīng)保護[8]、改善腦缺血損傷[9-10]等，這些藥理作用與梔子中的活性成分密切相關(guān)。眾多學者以靜態(tài)研究方法對梔子開展了多方面研究，確定了梔子苷等化學成分作為質(zhì)量控制依據(jù)[11]，代謝方面的研究成果多以代謝過程某一點揭示為主，例如在血漿、膽汁、尿液以及糞便中的代謝產(chǎn)物[12-14]。但以動態(tài)研究方法揭示梔子成分在機體內(nèi)的變化過程較少，更缺少以序貫代謝方法開展研究，模擬口服藥物后化學成分按照順序時間和連貫空間動態(tài)變化的過程[15-20]。序貫代謝是本課題組為全面、連續(xù)表征多成分藥物在空間和時間上的生物轉(zhuǎn)化提出的，通過調(diào)整給藥部位，經(jīng)腸系膜靜脈、股靜脈、腹主動脈取血，對入血成分進行動態(tài)分析，解析其代謝途徑，追蹤確證靶部位暴露成分，從而系統(tǒng)描繪出中藥多成分動態(tài)吸收和代謝的變化輪廓，在多成分藥物代謝的研究中發(fā)揮重要作用[18-19]。因此，本研究以序貫代謝研究方法，對梔子在大鼠體內(nèi)的多成分動態(tài)過程開展研究，分部位解析梔子及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的移行，為后續(xù)完善該藥材的質(zhì)控標準提供科學依據(jù)，也為揭示其藥效物質(zhì)基礎提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0010。實驗前，將大鼠飼養(yǎng)于晝夜節(jié)律光照條件下（溫度25～27 ℃，相對濕度50%～70%）適應性飼養(yǎng)7 d，保證其自由飲水攝食，實驗開始前12 h禁食不禁水。本研究中涉及的實驗動物方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號BUCM-4-2022061502-2062）。

1.2 藥材

梔子飲片購自北京同仁堂長陽藥店有限公司新悅都店，由北京中醫(yī)藥大學王晶娟教授鑒定為茜草科植物梔子Ellis的干燥成熟果實。

1.3 藥品與試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）、甲酸（質(zhì)譜純）購自賽默飛世爾科技有限公司；無水乙醇（分析純）購自天津大茂化學試劑廠；氯化鈉注射液購自石家莊四藥有限公司；醫(yī)用膠購自北京康派特醫(yī)療器械有限公司；肝素鈉注射液購自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；梔子苷（批號D22022113，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、京尼平（批號D22022501，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、京尼平苷酸（批號D21110915，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、山梔苷（批號D22041215，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、山梔苷甲酯（批號D22011709，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、梔子新苷（批號D22031004，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、順/反式西紅花苷Ⅰ（批號D21122101，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、大豆苷（批號D21060917，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司。

1.4 儀器

Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機、UltiMate 3000型超高效液相色譜儀、Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、DAD檢測器、Xcalibur質(zhì)譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BSA2202S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2A型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；1-15PK型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；CM-12型水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）；BT-100-1F型蠕動泵、LSP02-1B型注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

稱取200.20 g梔子粉末，加入10倍量50%乙醇，超聲（40 kHz、200 W）提取20 min，紗布濾過，濾渣按上述條件再次提取。合并2次提取液，取上清液用50%乙醇稀釋2倍后，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液進行液質(zhì)分析。提取液于50 ℃水浴蒸至稠膏狀約100 mL，雙層紗布濾過，用0.5%羧甲基纖維素鈉復溶混懸制成生藥量為1 g/mL的梔子提取物混懸液200 mL，于4 ℃儲存，作為灌胃液和灌流液備用。

2.2 腸代謝研究

2.2.1 腸壁代謝組 采用在體腸道灌流并行采血法實驗操作：隨機選取5只禁食12 h（不禁水）的大鼠，4只為供血組，1只為實驗組。麻醉大鼠，供血組腹主動脈采血后置于肝素鈉離心管，并于37 ℃水浴加熱，用于補充手術(shù)過程中損失的血液。實驗組大鼠首先剝離頸靜脈，插入靜脈留置針后滴加醫(yī)用膠黏合，將另一端連接到盛有供血的離心管中。沿腹中線剪開腹腔，選擇十二指腸以下約10 cm的空腸作為供試腸段，用5 mL注射器抽取37 ℃生理鹽水緩慢沖出腸內(nèi)容物，至流出液澄清，繼續(xù)充入空氣將生理鹽水排凈。在供試腸段首尾處各剪一小口并插入玻璃管引流液體，將梔子提取液（1 g/mL）注入腸段，末端開口排出，通過注射泵控制體積流量為0.2 mL/min。結(jié)扎肝門靜脈，在腸系膜靜脈插入充滿肝素鈉的靜脈留滯針，結(jié)扎周圍多余血管，另一端通過蠕動泵收集血液至干凈離心管。將紗布用37 ℃生理鹽水潤濕后覆蓋在裸露腸段上，保溫燈加熱保持大鼠體溫穩(wěn)定。開啟蠕動泵，進行頸靜脈輸血（體積流量0.3 mL/min），腸系膜靜脈采血，連續(xù)采血2 h后，處死大鼠。

2.2.2 腸道菌群代謝組 大鼠麻醉后選擇盲腸以下約8 cm的結(jié)腸腸段作為供試腸段，將梔子提取液注入腸腔，當藥液到達腸段末端，用手術(shù)線結(jié)扎末端，取下注射器并結(jié)扎腸段前端。其余操作同腸壁代謝組。采血2 h處死大鼠。平行實驗3組，空白組注射泵給予生理鹽水，其余操作相同。

2.3 肝代謝研究

肝代謝研究與腸代謝研究在手術(shù)操作上的不同在于是否結(jié)扎肝門靜脈以及采血點位置。肝代謝研究中不結(jié)扎肝門靜脈，并于股靜脈處采血，其他操作同“2.2”項下的腸代謝研究。

2.4 綜合代謝研究

選取3只SD雄性大鼠，ig 4 mL梔子提取液（1 g/mL），2次/d，持續(xù)3 d，末次給藥2 h后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，于4 ℃儲存，進行后續(xù)處理及分析?？瞻捉Mig生理鹽水，其余操作相同。

2.5 血液樣品處理

分別將收集的腸代謝、肝代謝、綜合代謝組血液進行合并后，4 ℃、4000 r/min離心10 min，分離得到血漿后，加入等體積的冰乙腈混合沉淀蛋白，渦旋2 min，4 ℃、8000 r/min離心10 min，取上清液進行氮吹，吹至100 μL，用50%甲醇300 μL復溶后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，供UPLC-HRMS分析。

2.6 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～1 min，10% A；1～4 min，10%～15% A；4～18 min，15%～30% A；18～24 min，30%～50% A；24～28 min，50%～100% A；28～31 min，100% A；31～32 min，100%～10% A；32～35 min，10% A；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣體積5 μL。

2.7 質(zhì)譜條件

采用加熱電噴霧離子化源（HESI），噴霧電壓分別為3.5 kV（HESI+）和3.0 kV（HESI?）；HESI溫度為400 ℃；毛細管加熱溫度為320 ℃；鞘氣和輔助氣均為氮氣，純度＞99%，碰撞氣為高純氮氣，純度＞99.99%；鞘氣壓力241.325 kPa；輔助氣壓力68.95 kPa；正離子和負離子模式同時采集，掃描范圍/100～1500；碰撞能量（NCE）為20%、40%、60%；質(zhì)譜分辨率70 000。

3 結(jié)果

3.1 梔子提取液中化學成分鑒定

根據(jù)“2.6”“2.7”項下條件對梔子提取物中的化學成分進行分析，梔子提取液的總離子流圖見圖1。將供試品與對照品的保留時間（R）、準分子離子峰、二級碎片和裂解規(guī)律進行比對，確定了其中的6個化學成分?；谖墨I調(diào)研并綜合對照品信息，建立含梔子化學成分名稱、分子式以及相對出峰順序等信息的數(shù)據(jù)庫，并借助Xcalibur 4.0軟件對總離子流圖上的峰進行精確相對分子質(zhì)量識別，共鑒定出46種化合物（表1），主要為環(huán)烯醚萜苷類、有機酸及其衍生物類、單萜類、黃酮類化合物。

3.1.1 環(huán)烯醚萜苷類化合物鑒定 從梔子提取液中共鑒別出梔子苷、梔子新苷和山梔苷等23個環(huán)烯醚萜苷類化合物。下面以梔子苷和山梔苷為例進行質(zhì)譜解析。

化合物17準分子離子為/387.129 4 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C17H24O10，R為4.87 min（誤差為0.693×10?6），二級碎片離子為/225.077 4 [M－H－C6H10O5]?、/207.066 8 [M－H－C6H10O5－H2O]?，分別為失去1分子葡萄糖基、繼而失去1分子H2O的碎片離子，此外還產(chǎn)生/123.045 4、101.024 6碎片離子。通過與文獻數(shù)據(jù)[21,25]比對及與對照品出峰時間比較，推測其為梔子苷。

圖1 梔子提取物在不同離子模式下的UPLC-HRMS總離子流圖

表1 梔子提取物中化學成分的UPLC-HRMS分析

Table 1 Identification of chemical components in extract of G. jasminoides by UPLC-HRMS

峰號tR/min電離模式母離子(m/z)誤差(×10?6)分子式MS2碎片離子鑒定結(jié)果 理論值實際值 10.91[M－H]?191.056 1191.055 91.555C7H12O6191.056 1奎寧酸[21] 20.98[M－H]?173.045 5173.045 31.512C7H10O5137.024 6, 111.045 4, 93.034 7莽草酸[22] 32.65[M－H]?391.124 6391.124 51.134C16H24O11229.072 1, 167.071 3山梔苷同分異構(gòu)體[21] 42.81[M－H]?403.124 6403.124 10.183C17H24O11241.072 3, 223.061 2, 127.040 2, 101.024 5去乙酰車葉草苷酸甲酯[21,23-24] 52.84[M－H]?389.108 9389.108 70.883C16H22O11389.109 2, 209.045 6, 183.066 2, 165.055 6, 147.045 2去乙酰車葉草苷酸[21,25] 62.98[M－H]?373.114 0373.113 70.639C16H22O10373.110 4, 211.061 2, 193.050 5, 167.071 2, 149.060 7, 123.045 1梔子新苷*[21,25] 73.13[M－H]?391.124 6391.124 51.221C16H24O11229.071 7, 211.060 9, 185.081 3, 167.071 1山梔苷*[21,23-24] 83.32[M－H]?403.124 6403.124 11.101C17H24O11241.072 2, 223.060 7, 193.050 1, 127.040 1, 101.024 6異梔子苷[21,23-24] 93.35[M－H]?373.114 0373.113 60.478C16H22O10211.061 8, 193.050 3, 146.060 6, 123.045 0, 167.071 0, 121.056 7京尼平苷酸*[21,24] 103.38[M－H]?403.124 6403.124 1?0.561C17H24O11241.072 2, 223.061 4,139.040 3雞矢藤次苷甲酯[21,23-24] 113.48[M－H]?405.140 2405.139 90.503 C17H26O11359.143 5, 197.082 4山梔苷甲酯*[21,25] 123.57[M－H]?375.129 7375.129 40.715C16H24O10213.077 4, 169.087 3, 151.076 7mussaenosidic acid[26] 133.73[M－H]?345.155 5345.155 20.775C16H26O8113.024 3, 101.024 2, 89.024 3jasminoside D[27] 143.96[M－H]?327.144 9327.144 70.832C16H24O7165.092 3zataroside B[23] 154.04[M－H]?353.087 8353.087 61.028C16H18O9191.056 4, 179.035 3, 135.045 33,5-O-咖啡?？崴醄24] 164.20 [M－H]?549.182 5549.181 5?0.883 C23H34O15225. 077 4, 207. 066 7京尼平-1-O-β-D-龍膽雙糖苷[21,25] 174.87[M－H]?387.129 7387.129 40.693 C17H24O10207.066 8, 225.077 4, 433.135 9, 123.045 4,101.024 6梔子苷*[21] 185.34[M－H]?345.155 5345.155 20.775C16H26O8301.042 5, 165.092 1, 183.102 8, 101.024 4, 89.024 5jasminoside B[21,24,27] 195.49[M－H]?353.087 8353.087 40.405C16H18O9191.056 6, 173.045 9, 179.065 8, 135.062 5綠原酸[21,25] 206.33[M－H]?179.035 0179.034 81.832C9H8O4135.045 4咖啡酸[24] 216.39[M－H]?183.102 7183.102 31.206C10H16O3139.113 1, 111.009 0, 137.097 1, 109.065 7, 123.080 5jasminodiol[23-25] 226.62[M－H]?503.177 0503.176 90.883C22H32O13223.145 1, 205.087 9, 190.211 32-methyl-lerythritol-4-O-(6-O-transsinapoyl)-β-D-glucopyranoside[26,28] 237.01[M－H]?359.134 8359.134 71.372C16H24O9359.135 1, 197.081 9, 179.070 9ixoroside[21,27] 247.44[M－H]?429.140 2429.139 80.335C19H26O11383.133 2, 361.150 6, 239.090 1, 181.087 810-acetyl geniposide[23]

續(xù)表1

峰號tR/min電離模式母離子(m/z)誤差(×10?6)分子式MS2碎片離子鑒定結(jié)果 理論值實際值 257.57[M－H]?519.150 8519.150 60.614C25H28O12163.040 1, 145.029 5, 123.045 2, 119.050 2, 149.060 86′-O-trans-coumaroyl geniposidic acid[27] 268.24[M－H]?551.177 0551.176 80.643C26H32O13357.119 6, 213.077 5, 193.050 9, 175.040 36-O-trans-p-coumaroyl gardenoside methyl ester[27] 279.89[M－H]?491.213 4491.213 30.954C22H36O12167.032 4, 323.101 5, 221.075 2, 161.058 0, 263.081 5jasminoside S/H/I[25-26] 2810.16[M－H]?579.171 9579.172 11.174C27H32O14205.050 6, 325.093 1, 367.103 7, 385.114 4, 223.061 1, 123.045 16′-O-trans-sinapoyl gardoside[27] 2910.43[M－H]?565.192 7565.192 40.574C27H34O13325.093 6, 295.082 8, 265.072 3, 223.061 811-(6-O-trans-sinapoylgluco pyranosyl)gardendiol[23,27] 3010.79[M－H]?609.146 1609.146 31.216C27H30O16301.035 9, 300.028 1, 271.025 5蘆丁[21] 3111.60 [M－H]?465.102 8465.101 80.938C21H20O12301.035 0, 271.024 5, 255.029 7異槲皮素苷[21,25] 3211.86[M－H]?593.151 2593.151 31.121C27H30O15325.092 5, 207.029 6, 93.034 4nicotiflorin[21] 3312.12[M－H]?755.240 4755.240 81.306C34H44O19123.076 5, 223.077 4, 205.425 5, 101.218 2, 427.066 56′′-O-trans-sinapoylgenipin gentiobioside[27] 3412.62[M－H]?725.229 8725.230 21.201C33H42O18225.077 3, 193.051 2, 123.045 46′′-O-trans-feruloyl genipin gentiobioside[21] 3512.69[M－H]?695.219 3695.219 20.742C32H40O17663.196 5, 469.136 3, 225.077 3, 145.029 8, 207.066 96′′-O-trans-p-coumaroylge nipin gentiobioside[21] 3613.08[M－H]?551.213 4551.213 30.742C27H36O12521.204 1, 367.014 2, 165.092 36′-O-trans-sinapoyl jasminoside L[21] 3713.34[M－H]?975.371 5975.371 00.044C44H64O24651.267 4, 327.160 9, 283.170 0, 239.180 0順/反式西紅花苷I* 3814.07[M－H]?593.187 6593.187 71.095C28H34O14367.105 5, 225.077 2, 223.061 0, 207.065 8, 205.051 2, 123.046 56′-O-sinapoylgeniposide[25,27] 3914.64[M－H]?515.119 5515.119 10.251C25H24O12353.088 8, 191.056 5, 173.045 83,5-二咖啡?？鼘幩醄21,25] 4015.51[M－H]?533.166 4533.166 30.786C26H30O12145.132 3, 123.130 5, 307.114 8, 225.087 96′-O-p-coumaroylgeniposide[23,27] 4115.67[M－H]?659.161 8659.162 11.366C31H32O16497.131 3, 191.056 4, 161.045 73,4-dicaffeovl-5-(3-hydroxy-3-methyl glutaroyl)quinic acid[23] 4216.44[M－H]?559.145 7559.145 50.616C27H28O13397.114 9,173. 045 93-caffeoyl-4-sinapoylquinate[25] 4317.45[M－H]?535.218 5535.218 30.716C27H36O11325.092 6, 265.071 5, 223.060 9, 205.050 46′-O-trans-sinapoyl jasminoside A[23,27] 4418.57[M－H]?533.202 8533.202 50.419C27H34O11205.051 1, 367.104 1, 223.061 3, 165.055 3, 190.027 56′-O-trans-sinapoyl jasminoside C[27] 4519.58[M－H]?345.061 6345.061 40.950C17H14O8315.014 9, 330.038 3, 287.019 95,7,3′,4′-tetrahydroxy-6,8-dimethoxy flavone[27] 4621.75[M－H]?813.318 7813.319 21.286C38H54O19651.267 6, 489.213 7, 369.170 9,327.161 1, 283.170 9, 179.056 4西紅花苷II[21,25]

*經(jīng)與對照品比對鑒別

*after comparison and identification with the reference substance

化合物7的R為3.13 min，準分子離子為/391.124 5 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C16H24O11（誤差為1.221×10?6），二級碎片離子有/229.071 7 [M－H－C6H10O5]?、/211.060 9 [M－H－C6H10O5－H2O]?、/185.081 3 [M－H－C6H10O5－CO2]?、/167.071 1 [M－H－C6H10O5－H2O－CO2]?，分別為失去１分子葡萄糖基，繼而失去1分子H2O或1分子CO2、再失去1分子H2O或1分子CO2的碎片離子。與文獻數(shù)據(jù)[21,23-24]對比，推測其為山梔苷，其裂解途徑見圖2。

3.1.2 有機酸及其衍生物類化合物鑒定 從梔子提取液中共鑒定出綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩岬?個有機酸及其衍生物類化合物。下面以綠原酸為例進行質(zhì)譜解析?；衔?9準分子離子為/353.087 4 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C16H18O9，R為5.49 min（誤差為0.405×10?6），二級碎片離子為/191.056 6 [M－H－C9H7O3]?、/179.056 8 [M－H－C7H11O5]?，分別為失去1分子咖啡酰氧基基團或奎尼酸基團形成的碎片離子，此外還產(chǎn)生/173.045 9、135.062 5碎片離子，進一步驗證化合物19是綠原酸類成分。文獻報道了綠原酸的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律，/191.056 6碎片響應最強，/179.065 8和/135.062 5強度都較弱。本實驗與報道的現(xiàn)象相似，推測化合物19可能為綠原酸，裂解規(guī)律見圖3。

圖2 負離子模式下山梔苷裂解途徑

3.1.3 黃酮類化合物鑒定 從梔子提取液中共鑒定出蘆丁、異槲皮苷等4個黃酮類化合物。下面以蘆丁和異槲皮苷為例進行質(zhì)譜解析?；衔?0準分子離子為/609.146 3 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C27H30O16，R為10.79 min（誤差為1.216×10?6），二級碎片離子為/301.035 9 [M－H－Rha]?、271.025 5 [M－H－Rha－CH2O]?，為失去1分子蕓香糖基、繼而丟失碳環(huán)羰基形成，表明該化合物可能為黃酮類，其苷元為槲皮素，與文獻數(shù)據(jù)[21]對比，推測其為蘆丁，裂解途徑見圖4?；衔?1準分子離子為465.101 8 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C21H20O12，R為11.60 min（誤差為9.38×10?7），二級碎片離子為/301.035 0 [M－H－C6H10O5]?、271.025 5 [M－H－C6H10O5－H2O]?、255.028 1 [M－H－H2O－CH2O]?，為失去1分子葡萄糖、繼而丟失1分子H2O形成，/255.028 1為槲皮素碎片丟失A環(huán)上1分子H2O后，進一步丟失碳環(huán)羰基形成的碎片，與蘆丁的二級碎片信息相似，具有和蘆丁相同的母核，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)[21,25]推測其為異槲皮苷。

圖3 負離子模式下綠原酸裂解途徑

圖4 負離子模式下蘆丁裂解途徑

3.1.4 萜類化合物鑒定 從梔子提取液中共鑒定出10個萜類化合物，包括8個單萜類成分和2個二萜色素類成分。下面以西紅花苷I和jasminoside B為例進行質(zhì)譜解析?；衔?7準分子離子為/975.371 0 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C44H64O24，R為13.34 min（誤差為0.044×10?6），二級碎片離子為/651.267 4 [M－H－2C6H10O5]?、327.160 9 [M－H－2C6H10O5－2C6H10O5]?，為失去一端的2分子糖基，繼而脫掉另一端的2個糖基形成，與文獻數(shù)據(jù)[21]對比，推測其為西紅花苷I，裂解途徑見圖5。梔子二萜色素類成分的裂解方式主要是糖苷鍵的斷裂，丟掉葡萄糖基團，再丟失CO2中性分子。化合物18準分子離子為/345.155 2 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C16H26O8，R為5.34 min（誤差為7.75×10?7），二級碎片離子為301.042 5 [M－H－CO2]?，165.092 1 [M－H－C6H11O6]?，分別為失去1分子CO2及1分子葡萄糖基形成，與文獻數(shù)據(jù)[21,24,27]對比，推測其為jasminoside B。

3.1.5 其他類別化合物鑒定 從梔子提取液中還鑒定出1個酚類化合物?；衔?4準分子離子為/327.144 7 [M－H]?，Qualbrowser軟件給出的精確分子式為C16H24O7，R為3.96 min（誤差為8.32×10?7），二級碎片離子為/165.092 3。與文獻數(shù)據(jù)[23]對比，推測其為zataroside B。

圖5 負離子模式下西紅花苷I裂解途徑

3.2 原型入血成分鑒定

通過對比不同處理組血漿及空白血漿，對腸代謝、肝代謝及綜合代謝組血漿樣品中原型入血成分進行統(tǒng)計，在各血漿樣品中共檢測到38個梔子原型入血成分，大多數(shù)為梔子苷、梔子新苷、山梔苷等環(huán)烯醚萜苷類成分。結(jié)合表2，在腸代謝中，腸壁代謝組和腸道菌群代謝組在原型入血成分上無差異，表明它們在胃內(nèi)穩(wěn)定并可以通過腸壁吸收入血。Yu等[29]采用腸灌注模型發(fā)現(xiàn)，梔子苷在整段小腸內(nèi)均有吸收，其中十二指腸吸收速率最大，吸收機制除被動擴散外，還有主動轉(zhuǎn)運和易化擴散。1、3、7～14、16、17、21、23這14種成分在4種血漿樣品均可以檢測到，說明以上成分不僅在胃內(nèi)穩(wěn)定，且無腸壁代謝、肝代謝，推測因小腸內(nèi)吸收快，無大腸內(nèi)的腸道菌群代謝，故原型成分在體循環(huán)穩(wěn)定。25～29、32～36、38、44、45這13種成分在腸代謝中可以檢測到，但并未在肝代謝及綜合代謝中檢測到，推測這些化合物可能經(jīng)過胃腸道吸收入血，可分布在肝臟中并經(jīng)由肝藥酶代謝?，F(xiàn)有研究表明，肝臟內(nèi)代謝酶細胞色素酶P450家族3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、硫酸基轉(zhuǎn)移酶2A1（sulfotransferases 2A1，SULT2A1）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）協(xié)同介導了京尼平于肝臟的代謝解毒，且CYP3A4是起決定因素的限速酶[30]。5、6、15、19、20、22、24、38～42這12種成分在腸代謝、肝代謝組血漿樣品中均可檢測到，但在綜合代謝樣品中未檢測到，推測原因可能是在胃內(nèi)進行了代謝。實驗結(jié)果表明，環(huán)烯醚萜苷類、有機酸類、酚類等成分均能以原型吸收入血，原型入血成分多達38個，而綜合代謝組血漿樣品的原型入血成分僅有14個，推測一方面由于綜合代謝采用ig給藥，定點采血，部分成分因吸收慢尚未進入血液，或成分吸收、代謝、排泄快，以代謝產(chǎn)物形式存在于血液循環(huán)中或排出體外，導致血液中未檢測到原型入血成分，另一方面胃液中的酸性環(huán)境也會使部分化合物發(fā)生水解。此外，由于結(jié)腸部分含有豐富的腸道菌群，推測化合物可能受到腸道菌群的影響而代謝轉(zhuǎn)化。

表2 梔子原型入血成分及代謝位點

Table 2 Prototypical blood components and metabolic sites of G. jasminoides

峰號化合物腸代謝肝代謝綜合代謝 腸壁代謝腸道菌群代謝 1奎寧酸YYYY 3山梔子苷同分異構(gòu)體YYYY 5去乙酰車葉草苷酸YYYND 6梔子新苷YYYND 7山梔苷YYYY 8異梔子苷YYYY 9京尼平苷酸YYYY 10去乙酰車葉草苷酸甲酯YYYY 11山梔苷甲酯YYYY 12mussaenosidic acidYYYY 13jasminoside DYYYY 14zataroside BYYYY 153,5-O-咖啡酰奎尼酸YYYND 16京尼平-1-O-β-D-龍膽雙糖苷YYYY 17梔子苷YYYY 19綠原酸YYYND 20咖啡酸YYYND 21jasminodiolYYYY 222-methyl-lerythritol-4-O-(6-O-transsinapoyl)-β-D-glucopyranosideYYYND 23ixorosideYYYY 2410-acetyl geniposideYYYND 256′-O-trans-coumaroyl geniposidic acidYYNDND 266-O-trans-p-coumaroyl gardenoside methyl esterYYNDND 27jasminoside S/H/IYYNDND 286′-O-trans-sinapoyl gardosideYYNDND 2911-(6-O-trans-sinapoylglucopyranosyl)gardendiolYYNDND 32nicotiflorinYYNDND 336′′-O-trans-sinapoylgenipin gentiobiosideYYNDND 346′′-O-trans-feruloyl genipin gentiobiosideYYNDND 356′′-O-trans-p-coumaroylge nipin gentiobiosideYYNDND 366′-O-trans-sinapoyl jasminoside LYYNDND 386′-O-sinapoylgeniposideYYNDND 393,5-二咖啡?？鼘幩醂YYND 406′-O-p-coumaroylgeniposideYYYND 413,4-dicaffeovl-5-(3-hydroxy-3-methyl glutaroyl)quinic acidYYYND 423-caffeoyl-4-sinapoylquinateYYYND 446′-O-trans-sinapoyl jasminoside AYYNDND 456′-O-trans-sinapoyl jasminoside CYYNDND

Y表示檢測到的成分 ND表示未檢測到的成分

Y-original blood component ND-component was not detected

3.3 代謝產(chǎn)物鑒定

在腸代謝中，腸壁代謝組和腸道菌群代謝組血漿樣品中鑒定出22個相同的代謝產(chǎn)物，包括山梔苷脫羧產(chǎn)物、梔子苷硫酸鹽結(jié)合物、山梔苷甲酯氫化產(chǎn)物等，詳細信息見表3，2組代謝產(chǎn)物基本無差異。大多數(shù)藥物在進入全身血液前都會經(jīng)歷肝代謝，通過比較肝代謝血漿樣品和空白血漿樣品，在肝代謝組中共鑒定出16個代謝產(chǎn)物，成分8、11、13、14、15、17在肝代謝樣品中消失，推測其在肝內(nèi)進行了進一步代謝。綜合代謝組中鑒定出14個代謝產(chǎn)物，主要包括梔子新苷水解產(chǎn)物、山梔苷甲酯去葡萄糖產(chǎn)物、綠原酸谷氨酰胺結(jié)合物等，詳細信息見表3。除綠原酸、槲皮素等的代謝成分外，主要代謝成分通過梔子苷、梔子新苷等環(huán)烯醚萜苷類代謝產(chǎn)生。以梔子苷、梔子新苷為代表的梔子環(huán)烯醚萜苷類成分主要代謝途徑包括氧化、水解、脫羧、葡萄糖醛酸化、結(jié)合硫酸鹽、谷氨酸、甘氨酸等，梔子中主要環(huán)烯醚萜苷類成分代謝途徑見圖6。

表3 梔子代謝成分鑒定結(jié)果

Table 3 Identification of metabolites of G. jasminoides

編號tR/min分子式電離模式母離子(m/z)誤差(×10?6)MS2碎片離子鑒定結(jié)果S1S2S3 理論值實測值S11S12 M12.75C15H24O9[M－H]?347.134 8347.135 31.591113.024 6, 95.014 0, 85.029 6, 59.014 0山梔苷脫羧產(chǎn)物[31]YYYND M23.17C17H24O13S[M－H]?467.086 5467.086 91.552223.060 6, 205.050 0梔子苷硫酸鹽結(jié)合物[14,17]YYYND M33.20C17H28O11[M－H]?407.155 9407.156 11.342361.151 4, 181.097 1, 101.024 5, 89.024 5山梔苷甲酯氫化產(chǎn)物[31]YYYND M43.36C10H14O5[M－H]?213.076 8213.066 71.410151.076 1, 137.060 3, 73.029 4梔子新苷水解產(chǎn)物[32]YYYY M53.53C17H26O12[M－H]?421.135 1421.136 12.027421.136 1山梔苷甲酯氧化產(chǎn)物[31]YYYND M63.69C11H16O6[M－H]?243.087 4243.087 51.195225.077 3, 169.087 2, 151.076 6, 149.060 9, 137.060 9, 73.029 6山梔苷甲酯去葡萄糖產(chǎn)物[31]YYYY M73.73C14H16N2O5[M－H]?291.098 6291.099 81.302291.017 7, 211.060 9, 79.957 2綠原酸谷氨酰胺結(jié)合物[17,32]YYYY M84.54C12H15NO5[M－H]?252.087 7252.088 21.531252.100 2, 186.078 0, 121.051 8梔子苷甘氨酸結(jié)合物[14,17]YYNDY M94.73C16H24O9[M－H]?359.134 8359.135 41.751359.135 7, 175.024 9, 113.024 6, 85.029 7山梔苷去氧產(chǎn)物[31]YYYND M104.92C23H34O16[M－H]?565.177 4565.178 31.969519.173 0, 225.077 3, 149.045 7, 123.045 3山梔苷甲酯葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[32]YYYND

續(xù)表3

編號tR/min分子式電離模式母離子(m/z)誤差(×10?6)MS2碎片離子鑒定結(jié)果S1S2S3 理論值實測值S11S12 M115.70C23H32O16[M－H]?563.161 8563.162 82.179387.108 1, 357.060 9, 299.019 1, 113.024 2梔子苷葡萄糖醛酸酯[14,17]YYNDY M127.07C11H11NO4[M－H]?220.061 5220.918 31.436220.918 3, 176.862 5, 148.954 8綠原酸甘氨酸結(jié)合物[32]YYYND M137.25C13H17NO4S[M－H]?282.080 6282.081 31.875282.097 8, 123.045 0, 114.055 8, 82.029 7梔子新苷半胱氨酸結(jié)合物[17,32]YYNDND M147.26C9H10O3[M－H]?165.055 7165.055 91.259165.055 9, 147.045 3, 119.050 4, 91.055 4, 77.040 0梔子苷酸去葡萄糖及羥甲基產(chǎn)物[32]YYNDND M157.29C10H12O5[M－H]?211.061 2211.060 61.550211.098 4, 167.108 0梔子苷酸去葡萄糖產(chǎn)物[14]YYNDY M167.52C16H26O9[M－H]?361.150 4 361.150 61.134361.151 3, 199.098 1, 181.087 2, 161.045 8, 137.097 3, 113.024 6, 101.024 5, 89.024 6, 71.014 0, 59.013 9mussaenosidic acid氫化產(chǎn)物[32]YYYND M177.83C11H14O8S[M－H]?305.033 7 305.034 21.646305.033 7, 225.0777, 79.9575, 59.013 9京尼平硫酸鹽結(jié)合物[32]YYNDND M189.43C10H10O5[M－H]?209.045 5 209.067 02.255209.080 1, 165.055 9, 135.418 4, 68.819 0梔子新苷成酮產(chǎn)物[32]YYYY M199.64C27H32O15[M－H]?595.166 8 595.168 32.583595.166 3, 295.083 0, 265.072 0, 209.045 8, 139.040 0京尼平1-龍膽二糖苷去甲基產(chǎn)物[32]YYYND M2012.30C21H18O11[M－H]?445.077 6 445.079 32.782269.046 1, 225.055 7, 224.048 0, 175.025 1, 181.066 0, 113.024 6槲皮素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[32]YYYY M2115.47C21H22O10[M－H]?433.114 0 433.114 81.857433.114 8, 257.082 5, 175.025 0, 135.009 3, 113.024 6, 109.029 6, 89.024 6, 85.029 6nicotiflorin去葡萄糖氫化產(chǎn)物[32]YYYY M2222.70C15H10O5[M－H]?269.045 5 259.046 11.600269.046 1, 224.047 9, 1 33.029 7, 107.014 0槲皮素去氧產(chǎn)物[32]YYYY

S1、S11、S12、S2、S3分別表示腸代謝組、腸壁代謝組、腸道菌群代謝組、肝代謝組和綜合代謝組血漿樣品

S1, S11, S12, S2and S3refer to plasma samples of intestinal metabolism group, intestinal wall metabolism group, intestinal flora metabolism group, liver metabolism group and comprehensive metabolism group respectively

4 討論

中醫(yī)藥高質(zhì)量發(fā)展的關(guān)鍵核心是建立科學合理的中藥質(zhì)量評價體系和高質(zhì)量的評價標準，只有不斷創(chuàng)新和完善中藥質(zhì)量評價模式，才能實現(xiàn)對中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的正向引導，保證中藥使用的安全有效[33]。2022年發(fā)布的“十四五中醫(yī)藥發(fā)展規(guī)劃”突出了提升中藥質(zhì)控水平是中藥研究的主要任務之一[34]。中藥具有多成分、多靶點、多通路的協(xié)同調(diào)控作用，然而并非所有成分均可發(fā)揮藥效，只有到達靶標并維持起效血藥濃度的成分才會產(chǎn)生治療作用。因此，通過鑒定入血成分及代謝產(chǎn)物，研究中藥的代謝情況對藥效物質(zhì)基礎的闡明和中藥質(zhì)量標準的提升具有重要意義。本研究將序貫代謝法和UPLC-HRMS相結(jié)合，采用在體動物實驗技術(shù)，分析了梔子醇提取液和梔子腸代謝、肝代謝以及綜合代謝3種不同處理組的含藥血漿樣品。3者的區(qū)別在于：腸代謝于空腸或結(jié)腸部位給藥，于腸系膜靜脈處取血，同時結(jié)扎肝門靜脈及旁支血管，故此時所收集的血漿樣品主要經(jīng)過腸壁酶或腸道菌群代謝；肝代謝組則不結(jié)扎肝門靜脈，故藥物經(jīng)過腸道代謝后還會經(jīng)過肝臟代謝；綜合代謝除了經(jīng)歷以上2種代謝方式外，還會經(jīng)過胃液代謝，是最接近傳統(tǒng)煎煮后口服給藥的方式。結(jié)合文獻與對照品比對，結(jié)果顯示，從梔子醇提取液中鑒定出46個化學成分，血漿樣品中共鑒定出38個結(jié)構(gòu)明確且以原型入血的成分及22個代謝產(chǎn)物。鑒定體內(nèi)代謝物主要為梔子苷、梔子新苷等環(huán)烯醚萜苷類經(jīng)氧化、水解、脫羧、葡萄糖醛酸化等反應生成，這與《中國藥典》2020年版一部[1]中梔子藥材以梔子苷作為含量測定指標成分相符，表明以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分是進入體內(nèi)的主要成分，也可能是臨床發(fā)揮藥效的潛在活性成分。已有文獻報道，上述入血成分中梔子苷、京尼平苷酸、綠原酸、6′---sinapoyl jasminoside C等成分具有抗炎、保肝利膽、促進胰腺分泌、降血糖等藥理作用[35]。如梔子苷可通過降低炎癥細胞因子水平發(fā)揮抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用，通過升高白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平，降低IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α水平，抑制炎癥和氧化應激，并促進組織修復和再生，發(fā)揮肝臟保護作用[36]。

針對中藥及其復方成分復雜多樣的特點[37-38]，序貫代謝方法能夠明確各成分在多成分環(huán)境下的代謝變化，從而縮小發(fā)現(xiàn)活性成分的范圍，減少體外活性成分研究的盲目性和片面性，實現(xiàn)對入血成分的系統(tǒng)、全面表征。是研究藥物體內(nèi)吸收代謝情況的強有力技術(shù)手段[20]。綜上，本研究解析了梔子化學成分在大鼠體內(nèi)的代謝情況和代謝部位的成分差異，為研究梔子藥效物質(zhì)基礎提供了科學的數(shù)據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Sequential metabolism of multi-components ofin rats based on UPLC-HRMS

LIU Hui-ning1, LIU Lei2, YU Shuang1, LI Xue-yan1, WANG Xin-yu1, QI Dong-ying1, PAN Fu-lu1, CHAI Xiao-yu1, WANG Qian-qian1, PAN Yan-li3, LIU Yang1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Pinzhencao (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100022, China 3. Institute of Information on Traditional Chinese Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To identify the prototype components and metabolites in different plasma samples after administration, and study the metabolism of chemical components ofin different parts of rats by sequential metabolism method combined with ultra-high-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) technology.extract was firstly prepared, and then plasma samples of intestinal wall metabolism, intestinal flora metabolism and liver metabolism were collected by intestinal perfusion and closed intestinal loop method, and comprehensive metabolic blood samples were collected after intragastric administration and the components in samples were analyzed and identified by UPLC-HRMS.A total of 46 chemical components including iridoid glycosides, terpenes, organic acids and gardenia yellow pigments were identified from the extract of. The results of sequential metabolism study showed that 38 prototype blood components and 22 metabolites were identified in intestinal metabolism samples, 25 prototype blood components and 16 metabolites were identified in liver metabolism samples, and 14 prototype blood components and 10 metabolites were identified in metabolome samples.Based on sequential metabolism method, this study analyzes the prototype blood components and metabolites ofextract in rats, and the differences in components of different metabolic sites provide a basis for elucidating the biotransformation process ofmetabolic components

Ellis; multicomponent sequential metabolism; ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS); prototype components; metabolites; iridoid glycosides; geniposide; gardoside

R285.61

A

0253 - 2670(2023)18 - 5980 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.016

2023-03-01

國家自然科學基金資助項目（81973295）

劉慧寧，碩士研究生，研究方向為藥靶結(jié)合動力學與藥物代謝。E-mail: 857796775@qq.com

劉 洋，男，博士，教授，研究方向為藥靶結(jié)合動力學與藥物代謝。E-mail: liuyang@bucm.edu.cn

潘艷麗，女，博士，研究員，從事醫(yī)藥信息學研究。E-mail: panely@163.com

[責任編輯 李亞楠]