戴 玲，駱 妍，侯光菡，王 樂，李 歡，孟 盼*

健腦解郁方對(duì)腦小血管病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬突觸可塑性的影響

戴 玲1，駱 妍2，侯光菡3，王 樂2，李 歡2，孟 盼2*

1. 湖南科技職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410200 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3. 長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410200

探討健腦解郁方對(duì)腦小血管病并發(fā)抑郁癥（cerebral small vessel disease related with depression，CSVDD）模型大鼠海馬突觸可塑性的干預(yù)作用及機(jī)制。將40只SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平（21.6 mg/kg）＋丁苯酞（54 mg/kg）＋氟西?。?.4 mg/kg）組和健腦解郁方高、中、低劑量（28.08、14.04、7.02 g/kg）組，每組8只，另取8只WKY大鼠作為對(duì)照組，大鼠背部sc-半乳糖（400 mg/kg）8周聯(lián)合雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）4周及慢性不可預(yù)見性溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）4周制備CSVDD模型。采用糖水偏好率實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠抑郁樣行為；ELISA法檢測(cè)大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、谷氨酸（glutamate，Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；激光微循環(huán)血流成像觀察腦血流量；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠海馬CA3區(qū)血管周圍間隙情況；普魯士藍(lán)（LFB）染色觀察大鼠腦白質(zhì)胼胝體病理變化；TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡；免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬CA3區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、突觸素（synaptophysin，Syn）及突觸后致密蛋白-95（post synaptic density-95，PSD-95）的表達(dá)。與模型組比較，健腦解郁方組大鼠糖水偏好率顯著升高（＜0.05），自主活動(dòng)顯著增加（＜0.05），游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少（＜0.05），逃避潛伏期和目標(biāo)象限潛伏期顯著縮短（＜0.05、0.01）；腦血流量顯著上升（＜0.05、0.01）；血清中5-HT和GABA水平顯著升高（＜0.05），NO、ET-1、Glu、IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01）；海馬CA3區(qū)擴(kuò)大的血管周圍間隙數(shù)量減少，病理損傷明顯減輕，胼胝體髓鞘損傷減輕；海馬CA3區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（＜0.01），BDNF、Syn和PSD-95表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01）。健腦解郁方可能通過促進(jìn)海馬突觸可塑性，提升神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給，降低海馬神經(jīng)元凋亡，以此改善腦組織海馬及白質(zhì)區(qū)域病理損傷，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的表達(dá)，改善CSVDD模型大鼠認(rèn)知及情緒障礙。

健腦解郁方；腦小血管病并發(fā)抑郁癥；神經(jīng)可塑性；凋亡；神經(jīng)內(nèi)分泌；芍藥苷；地黃苷A；金絲桃素；西紅花苷I；莫諾苷

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）是由顱內(nèi)微小血管的動(dòng)態(tài)彌漫性病變所致的腦微血管疾病，在中老年人群中發(fā)病率超過70%[1]，具有高隱匿性、高發(fā)病率、高致殘率等特點(diǎn)[2]。腦小血管病并發(fā)抑郁癥（cerebral small vessel disease related with depression，CSVDD）在CSVD患者中的發(fā)病率為0.9%～42%[3]，跨度范圍大且逐年增加[4]?！把苄砸钟舭Y”假說提出CSVD是抑郁癥的重要病因[5]，CSVDD將成為腦病領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)，其潛在的發(fā)病機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議[6]。

突觸可塑性包含感知、評(píng)估、存儲(chǔ)復(fù)雜信息及對(duì)相關(guān)刺激做出適應(yīng)性反應(yīng)的能力，是大腦最基本和最重要的功能之一[7]。CSVDD發(fā)生后，患者神經(jīng)功能障礙可能與突觸可塑性的降低密切相關(guān)。磁共振成像顯示，CSVD誘發(fā)的認(rèn)知障礙患者出現(xiàn)不同程度的海馬亞區(qū)萎縮[8]，海馬萎縮表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目減少、功能受損及神經(jīng)元固縮喪失。因此推測(cè)海馬突觸功能可塑性是CSVDD后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵，也是改善CSVD患者預(yù)后的重點(diǎn)。

課題組基于腦小血管病并發(fā)抑郁癥“虛、瘀、郁”的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)，立補(bǔ)腎健脾、活血通絡(luò)、疏肝解郁的治法，創(chuàng)健腦解郁方。該方以固元健腦方合百事樂方加減而成。其中，固元健腦方是課題組篩選的臨床經(jīng)驗(yàn)方，而百事樂方是課題組研發(fā)的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗抑郁中藥復(fù)方（專利號(hào)CN101816766A）。本研究通過構(gòu)建CSVDD大鼠模型，以海馬突觸可塑性為切入點(diǎn)，探討健腦解郁方是否可通過調(diào)控海馬CA3區(qū)域突觸可塑性從而發(fā)揮對(duì)CSVDD大鼠神經(jīng)元的保護(hù)功能，改善神經(jīng)功能障礙。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性14周齡SHR大鼠40只、SPF級(jí)雄性14周齡WKY大鼠8只，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證為SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（湘）2019-0009]，室溫（25±2）℃，光暗周期12 h/12 h，相對(duì)濕度（50±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)LLBH-202011090001）。

1.2 藥材

健腦解郁方由熟地黃15 g、白芍10 g、西紅花5 g、山茱萸6 g、山藥10 g、石菖蒲10 g、姜黃10 g、貫葉連翹5 g、炙甘草5 g等組成，以上藥材均購(gòu)自北京同仁堂，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房張志國(guó)教授分別鑒定為玄參科植物地黃Libosch.的塊根經(jīng)加工蒸曬而成、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根、鶯尾科植物番紅花L.的干燥柱頭、山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉、天南星科植物石菖蒲Schott的干燥根莖、姜科植物姜黃L.的干燥根莖、藤黃科植物貫葉連翹L.的全草、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖經(jīng)炮制加工而成。課題組采用LC-MS/MS法對(duì)健腦解郁方的成分進(jìn)行分析，共鑒定出36種化合物，并對(duì)其中5種主要成分進(jìn)行了定量分析，含芍藥苷1.98 mg/g、地黃苷A 0.24 mg/g、金絲桃素2.6 mg/g、西紅花苷I8.57 mg/g、莫諾苷0.36 mg/g。

1.3 藥品與試劑

尼莫地平（批號(hào)H14022821）購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；丁苯酞（批號(hào)H20050299）購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；氟西?。ㄅ?hào)2019024）購(gòu)自禮來（蘇州）制藥有限公司；-半乳糖（批號(hào)V900922）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；突觸后致密蛋白95（post synaptic density 95，PSD95）抗體（批號(hào)20665-1-AP）、突觸素（synaptophysin，Syn）抗體（批號(hào)67864-1-lg）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)28205-1-AP）、山羊抗小鼠488抗體（批號(hào)SA00013-1）、購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；山羊抗兔488抗體（批號(hào)GB25303）、髓鞘染液試劑盒（批號(hào)G1030）購(gòu)自Servicebio公司；山羊抗兔594抗體（批號(hào)ab150080）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)S0021S）購(gòu)自上海碧云天公司；內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、谷氨酸（glutamate，Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)分別為E-EL-R1458c、E-BC-K020-M、E-BC-K096-M、E-BC-K025-M、E-EL-R0362c、E-EL-R2536c）購(gòu)自武漢Elabscience公司。

1.4 儀器

MK3型多功能酶標(biāo)儀、HM430型生物組織切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；BM-I型生物組織包埋機(jī)（湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；Stemi 508型光學(xué)顯微鏡、LSM900型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）；Pannoramic MIDI數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（匈牙利3DHISTECH公司）；FLPI-2型激光微循環(huán)血流成像儀（英國(guó)Moor公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

SHR大鼠背部sc-半乳糖（400 mg/kg）連續(xù)8周聯(lián)合雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）4周，進(jìn)而采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激加孤籠飼養(yǎng)，建立CSVDD大鼠模型。大鼠ip 10%水合氯醛（3.5 mg/kg）麻醉，仰臥固定于木板上，采用脫毛膏脫去頸部毛發(fā)裸露出皮膚，乙醇消毒，頸腹正中切口暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，小心地將其與迷走神經(jīng)分離，在內(nèi)外頸動(dòng)脈分叉前1 cm處，將直徑0.45 mm注射器針頭扎在雙側(cè)頸總動(dòng)脈上，在確?；罱Y(jié)牢固固定后，小心拔出針頭，保證血管內(nèi)有一定血流量通過，BCAS成功后，噴灑青霉素并縫合傷口消毒[9]。將CSVD成模大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平（21.6 mg/kg）＋丁苯酞（54 mg/kg）＋氟西?。?.4 mg/kg）組和健腦解郁方高、中、低劑量（28.08、14.04、7.02 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的2、1、0.5倍）組，每組8只，另取WKY大鼠背部sc 0.9%生理鹽水作為對(duì)照組。

采用慢性不可預(yù)見性溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）加孤籠飼養(yǎng)進(jìn)一步建立CSVDD大鼠模型，慢性應(yīng)激的方法包括：①禁食24 h；②禁水24 h；③潮濕墊料24 h；④夾尾2 min；⑤晝夜顛倒24 h；⑥噪音4 h；⑦50 V電擊3 min；⑧4 ℃冰水浴3 min，每天隨機(jī)安排1～2種刺激，同種刺激3 d內(nèi)不重復(fù)出現(xiàn)，電擊和夾尾刺激每周限1次，共21 d。各組大鼠于CUMS造模期間同時(shí)ig給藥（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)21 d后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，并立即取材。

2.2 行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開始前，將大鼠進(jìn)行分籠，每只大鼠給予2個(gè)規(guī)格和外觀相同的水瓶，第1天為2瓶1%純凈水，第2天為1瓶1%蔗糖水及1瓶純凈水，第3天交換2個(gè)水瓶的位置，訓(xùn)練時(shí)間持續(xù)24 h。適應(yīng)結(jié)束后，禁食禁水24 h，提前稱定并記錄1%蔗糖與純凈水含量，2 h后交換水瓶位置，檢測(cè)結(jié)束記錄剩余的蔗糖水與純凈水，計(jì)算糖水偏好率。

糖水偏好率＝蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量＋純凈水消耗量)

2.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要是用來觀察動(dòng)物的自主活動(dòng)行為和探究行為，將大鼠從同一位置放入規(guī)格為50 cm×50 cm×50 cm、底板和四壁均為藍(lán)色且底部劃為25個(gè)小格的清潔敞箱內(nèi)，適應(yīng)30 s后，記錄大鼠3 min內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)（四爪均在格內(nèi)）和垂直站立次數(shù)（兩前爪抬起）。每次測(cè)試后，用酒精棉擦拭敞箱的內(nèi)壁和底部，避免氣味相互干擾下一只大鼠的測(cè)試，實(shí)驗(yàn)過程中保持房間內(nèi)光線一致且安靜。

2.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入25 cm×30 cm的圓筒中，圓筒中水的高度以大鼠伸展全身而后足不觸碰圓筒底部，且大鼠不能跳出圓筒為準(zhǔn)。大鼠放入圓桶后，先適應(yīng)性游泳30 s，而后觀察并記錄3 min內(nèi)大鼠在水中保持漂浮狀態(tài)、四肢不動(dòng)的禁止不動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中注意保證同期實(shí)驗(yàn)大鼠之間不可見，以減少干擾。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

造模結(jié)束后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練。從同一位置將大鼠面壁放入水中，若60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則牽引至平臺(tái)停留30 s，訓(xùn)練4 d。用以訓(xùn)練其找到水下平臺(tái)（實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)的位置始終保持不變）。第5天時(shí)，將大鼠從適應(yīng)期同一位置放入水中，記錄其找到水下平臺(tái)的時(shí)間，記為逃避潛伏期。第6天時(shí)，撤離水下平臺(tái)，將大鼠放入水中，記錄其在原平臺(tái)所在目標(biāo)象限中的游泳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)期間需要保持室內(nèi)安靜，物品放置及燈光狀態(tài)一致，水溫（24±1）℃。

2.4 血清中NO、ET-1、5-HT、Glu、GABA、IL-6和TNF-α水平的測(cè)定

大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采集血液，3000 r/min離心15 min后取上清。按照試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠血清中NO、ET-1、5-HT、Glu、GABA、IL-6和TNF-α水平。

2.5 激光斑點(diǎn)對(duì)比成像檢測(cè)腦血流量

大鼠ip 10%水合氯醛（3.5 mg/kg）麻醉，將其頭部固定于腦立體定位儀上。去除頭皮、皮下結(jié)締組織和骨膜，乙醇消毒，隨后使用牙鉆將顱骨輕輕磨薄，直到顯示出內(nèi)部致密的椎板，硬膜外血管和軟腦膜血管清晰可見，在此過程中使用生理鹽水時(shí)刻保持顱骨濕潤(rùn)。通過激光微循環(huán)血流成像儀檢測(cè)腦血流量。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)腦組織病理變化

取4%多聚甲醛固定的腦組織，石蠟包埋，切片（厚4 μm）后進(jìn)行染色。脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅復(fù)染、無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。玻片晾干后，顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理變化。

2.7 普魯士藍(lán)（LFB）染色檢測(cè)腦組織髓鞘損傷情況

取腦組織石蠟切片（厚4 μm），根據(jù)髓鞘染液試劑盒說明書進(jìn)行操作。脫蠟、水化、染色、分化、脫水、透明，中性樹膠封片。玻片晾干后，顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織髓鞘損傷情況。

2.8 TUNEL染色檢測(cè)海馬組織細(xì)胞凋亡情況

取各組大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定30 min，0.25% TritonX-100處理10 min，3% H2O2作用2 min，PBS洗滌3次；加入TUNEL工作液，37 ℃避光孵育1 h；棄去液體，PBS洗滌3次，加入DAPI工作液，室溫避光孵育15 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組海馬組織凋亡情況。

2.9 免疫熒光法檢測(cè)海馬CA3區(qū)中BDNF、Syn和PSD-95蛋白表達(dá)

取各組大鼠左側(cè)大腦，多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋并切片，隨后脫蠟和梯度乙醇脫水，以免疫組化筆圈出組織并進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用PBS漂洗3次，每次5 min。再用10%牛血清白蛋白封閉30 min，甩掉封閉液，隨后分別在組織上滴加BDNF、Syn、PSD-95抗體，于濕盒內(nèi)4 ℃過夜。第2天，取出玻片并于室溫平衡10 min，隨后用PBS漂洗4次，每次5 min。輕甩PBS，在組織上滴加二抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗4次，每次5 min。甩掉PBS，DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min，再用PBS漂洗3次，每次5 min。隨后用抗熒光猝滅劑進(jìn)行封片，并于熒光顯微鏡下觀察和采集圖像，分析海馬CA3區(qū)中BDNF、Syn及PSD-95的熒光強(qiáng)度。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠抑郁樣行為的影響

3.1.1 各組大鼠糖水偏好率 如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠糖水偏好率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，健腦解郁方高、中劑量組大鼠糖水偏好率均明顯升高（＜0.05），提示CSVDD大鼠存在明顯的快感缺乏癥狀，而健腦解郁方可顯著提高CSVDD模型大鼠對(duì)快感的反應(yīng)，緩解其抑郁癥狀。

3.1.2 各組大鼠自主活動(dòng)情況 如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠4 min內(nèi)的水平和垂直活動(dòng)均顯著降低（＜0.05、0.01），自主活動(dòng)能力降低；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠的水平和垂直活動(dòng)均明顯增加（＜0.05）。

C-對(duì)照組 M-模型組 P-尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組 L-健腦解郁方低劑量組 M-健腦解郁方中劑量組 H-健腦解郁方高劑量組 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖2 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠自主活動(dòng)的影響(, n = 8)

3.1.3 各組大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間 如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間均顯著降低（＜0.05）。

3.1.4 各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力 如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期和目標(biāo)象限潛伏期均明顯延長(zhǎng)（＜0.05、0.01），提示大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力下降且認(rèn)知功能發(fā)生障礙；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠逃避潛伏期和目標(biāo)象限潛伏期均顯著縮短（＜0.05、0.01）。

圖3 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(, n = 8)

圖4 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響(, n = 8)

3.2 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血管舒縮功能的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中NO水平顯著下降（＜0.01），ET-1水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組血清中NO和ET-1水平均明顯改善（＜0.05、0.01）。

3.3 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠腦血流量的影響

如圖6所示，第5周（BCAS造模后1周）檢測(cè)大鼠腦血流量，與對(duì)照組比較，其余各組大鼠腦血流量均顯著降低（＜0.01）。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠腦血流量均顯著上升（＜0.05、0.01）。

圖5 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血清中NO和ET-1水平的影響(, n = 3)

圖6 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠腦血流量的影響(, n = 3)

3.4 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中5-HT和GABA水平顯著下降（＜0.05、0.01），Glu水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組血清中GABA水平顯著上升（＜0.05），尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組血清中5-HT水平顯著上升（＜0.05），Glu水平明顯下降（＜0.05）。

圖7 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血清中5-HT、Glu和GABA水平的影響(, n = 8)

3.5 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血清中炎癥因子水平的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組血清中IL-6和TNF-α水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組IL-6、TNF-α水平顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.6 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠海馬CA3區(qū)病理變化的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)可見明顯的血管周圍間隙擴(kuò)張，表現(xiàn)為橢圓形或圓形，主要環(huán)繞于血管周圍，有較多絲狀物附著，具有透明腔隙；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組海馬CA3區(qū)血管周圍間隙擴(kuò)張情況有所改善，數(shù)量減少，無明顯絲狀物附著。

3.7 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠海馬胼胝體區(qū)髓鞘結(jié)構(gòu)變化的影響

如圖10所示，對(duì)照組大鼠胼胝體內(nèi)包含致密的深藍(lán)色絲狀物延伸，髓鞘藍(lán)染清晰，無脫髓鞘改變；模型組胼胝體大面積呈淺藍(lán)色，髓鞘著色少而淺，纖維紋理不清，排列疏松，結(jié)構(gòu)紊亂變形，呈空泡或空網(wǎng)狀改變；尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組胼胝體染色程度及髓鞘結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，板層清晰，結(jié)構(gòu)致密，形態(tài)完整。

3.8 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

如圖11所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多（＜0.01），呈染色質(zhì)濃染的典型凋亡特征；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組海馬CA3區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著下降（＜0.01）。

圖8 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 8)

圖9 各組大鼠海馬CA3區(qū)病理變化 (HE, ×20)

圖10 各組大鼠胼胝體區(qū)髓鞘結(jié)構(gòu)變化(LFB, ×40)

圖11 各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡情況(, n = 3)

3.9 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)的影響

如圖12所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.10 健腦解郁方對(duì)CSVDD大鼠海馬CA3區(qū)Syn和PSD-95表達(dá)的影響

如圖13所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)Syn和PSD-95陽性表達(dá)均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)PSD-95陽性表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01），尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠海馬CA3區(qū)Syn陽性表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖12 各組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF表達(dá)(, n = 3)

圖13 各組大鼠海馬CA3區(qū)Syn和PSD-95表達(dá)(, n = 3)

4 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，CSVD可歸屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“癡呆”“顫證”“眩暈”等的范疇，抑郁癥歸屬于中醫(yī)“郁證”的范疇。CSVD病位在腦，與腎、肝、脾密切相關(guān)，乃本虛標(biāo)實(shí)之證。CSVD與抑郁癥互為因果，相兼為病。CSVDD的基本病機(jī)可用“虛、瘀、郁”概括，治療當(dāng)以“補(bǔ)腎健脾、理氣活血、化痰通絡(luò)、疏肝解郁”為法。本研究所采用的健腦解郁方由固元健腦方和百事樂方加減而成，方中熟地黃滋陰補(bǔ)腎、益精填髓，用以為君。臣以山茱萸補(bǔ)益肝腎，助君藥補(bǔ)腎固本；山藥脾腎雙補(bǔ)；石菖蒲開竅豁痰、醒神益智；西紅花活血化瘀；姜黃活血行氣，主治血瘀氣滯諸證。佐以貫葉連翹活血解郁；白芍養(yǎng)血柔肝、平抑肝陽；炙甘草調(diào)和諸藥，用以為使。全方共奏補(bǔ)腎健脾、理氣活血、化痰通絡(luò)、疏肝解郁之功效。

CSVD是指由于各種病因影響腦內(nèi)小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、毛細(xì)血管、微靜脈和小靜脈所導(dǎo)致的一系列臨床、影像、神經(jīng)病理綜合征。主要表現(xiàn)為近期皮質(zhì)下小梗死、腔隙性梗死、白質(zhì)高信號(hào)、血管周圍間隙、微出血和腦萎縮等[10]，其誘發(fā)的認(rèn)知障礙、情緒和活動(dòng)主動(dòng)性減少等抑郁癥狀極大地降低了CSVD患者的生存質(zhì)量及治療效果[11]。高血壓是導(dǎo)致顱內(nèi)小動(dòng)脈和小靜脈管壁增厚的主要因素，引起腦內(nèi)低灌注，進(jìn)而形成CSVD，同時(shí)會(huì)增大認(rèn)知功能損害的風(fēng)險(xiǎn)[12]。研究表明，CSVD發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，多發(fā)于60歲以上人群[1]。其中，67.92%的老年CSVD認(rèn)知障礙患者患有長(zhǎng)期高血壓[13]。研究表明，低灌注會(huì)導(dǎo)致腦白質(zhì)病變，是由深穿支動(dòng)脈損害引起的慢性缺血。BCAS可在一定程度上減少腦血流，并在頸總動(dòng)脈及其分支中保持殘余血流量[14]。由此可見，高血壓、衰老及低灌注模型三者聯(lián)合作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，復(fù)合動(dòng)物模型比單一的軀體應(yīng)激或藥物刺激更能模擬CSVD的臨床表征。由于CSVDD的發(fā)病機(jī)制尚不明晰，更進(jìn)一步滯后了該疾病的早期預(yù)防與診斷。既往研究表明，采用不對(duì)稱頸總動(dòng)脈手術(shù)創(chuàng)建的CSVD小鼠模型會(huì)引發(fā)海馬神經(jīng)元萎縮及核固縮[15]。腦損傷會(huì)導(dǎo)致突觸密度降低，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞，神經(jīng)環(huán)路傳遞信息受損，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷[16]。本研究采用-半乳糖（400 mg/kg，8周）聯(lián)合BCAS（4周）及CUMS（4周）制備CSVDD大鼠模型，根據(jù)行為學(xué)評(píng)估結(jié)果，CSVDD大鼠糖水偏好率和自發(fā)活動(dòng)行為減少，靜止不動(dòng)時(shí)間增加，逃避潛伏期和目標(biāo)象限潛伏期明顯延長(zhǎng)，表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙及情緒低落，而給予高劑量的健腦解郁方治療則可顯著改善模型大鼠認(rèn)知及情緒障礙。

NO是大腦血管內(nèi)的神經(jīng)活性物質(zhì)，可在不同程度上調(diào)節(jié)血管張力并輔助細(xì)胞間的信息傳遞[17]。ET-1是一種血管收縮肽和血流調(diào)節(jié)因子，與血管內(nèi)皮功能有關(guān)，研究證實(shí)血管內(nèi)皮功能紊亂是引起腦小血管損傷的重要啟動(dòng)因子。腦缺血缺氧時(shí)，炎癥因子釋放激活血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致ET-1釋放增加，誘導(dǎo)腦白質(zhì)損傷，損傷神經(jīng)纖維網(wǎng)，引發(fā)認(rèn)知功能損傷[18]。研究表明，CSVD大鼠小動(dòng)脈中血流量及紅細(xì)胞流速均顯著降低[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中NO水平顯著下降，ET-1水平顯著上升，而尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組NO水平顯著上升，ET-1水平明顯下降。提示該方可通過調(diào)節(jié)血管舒縮功能及腦血流量來改善大鼠的抑郁狀態(tài)。

動(dòng)物的體內(nèi)含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量是評(píng)估抑郁模型的關(guān)鍵指標(biāo)[20]。大腦中大部分突觸是以Glu為遞質(zhì)的興奮性突觸，在感覺傳遞、運(yùn)動(dòng)控制中發(fā)揮重要作用，其過度表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及凋亡[21]。GABA則介導(dǎo)腦內(nèi)的抑制性突觸傳遞，對(duì)中樞神經(jīng)元產(chǎn)生普遍的抑制效果[21]。研究表明，腦內(nèi)Glu水平的升高及GABA水平的降低與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[22-23]。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中5-HT、GABA水平顯著下降，Glu水平顯著上升，而健腦解郁方中劑量組5-HT水平顯著上升，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組5-HT、GABA水平顯著上升，Glu水平明顯下降。提示該方可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的表達(dá)來改善大鼠的抑郁狀態(tài)。

臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平的升高，會(huì)加重血管內(nèi)皮功能障礙、血腦屏障滲漏及腦白質(zhì)損傷[24]。抑郁障礙被認(rèn)為是一種精神神經(jīng)免疫性失調(diào)，其可能是由于炎癥細(xì)胞因子作用導(dǎo)致的免疫激活，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)功能紊亂[25]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著上升，而尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組IL-6、TNF-α水平顯著下降。

海馬是一個(gè)具有結(jié)構(gòu)、功能可塑性的關(guān)鍵腦區(qū)，分為CA1、CA2、CA3、DG 4區(qū)，分別由錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞形成。CA3區(qū)被認(rèn)為與空間辨別性學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)的關(guān)系尤為密切[26]。血管周圍間隙是指包繞血管或沿血管走形、直徑小于3 mm的間隙，而血管周圍間隙擴(kuò)大是CSVD腦磁共振成像的影像特征之一，但其病因目前還不完全清楚[27]。模型組大鼠海馬CA3區(qū)可見明顯的血管周圍間隙擴(kuò)張，有較多絲狀物附著，展現(xiàn)出較大的透明腔隙，而健腦解郁方高劑量組可顯著減少血管周圍間隙擴(kuò)張數(shù)量。以上結(jié)果表明，高劑量的健腦解郁方可減輕CSVDD大鼠病理損傷，緩解抑郁癥狀。

大腦白質(zhì)主要由神經(jīng)元軸突、包裹軸突的髓鞘和膠質(zhì)細(xì)胞組成。髓鞘可支持軸突與外界之間的信息傳導(dǎo)[28]，使神經(jīng)系統(tǒng)具備快速高效的整合能力，對(duì)于認(rèn)知功能十分重要[29]。胼胝體作為大腦中最大的白質(zhì)帶，可清晰直觀地進(jìn)行觀察。LFB結(jié)果顯示模型組大鼠胼胝體髓鞘纖維紋理不清，排列疏松，結(jié)構(gòu)紊亂變形，呈空泡或空網(wǎng)狀改變，而健腦解郁方高劑量組明顯改善胼胝體的病理損傷，髓鞘結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，板層清晰，結(jié)構(gòu)致密。

突觸是構(gòu)成神經(jīng)元之間或神經(jīng)元與非神經(jīng)元之間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一種特化結(jié)構(gòu)，而突觸可塑性是突觸形態(tài)及功能發(fā)生改變的特性或現(xiàn)象[7]，海馬突觸可塑性結(jié)構(gòu)和功能的改變與抑郁程度密切相關(guān)[30]。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的核心成員，是海馬新突觸發(fā)生、改建及傳遞效能等功能的重要調(diào)節(jié)因子，在突觸可塑性變化中發(fā)揮重要作用[31]。臨床研究表明，血清中BDNF水平與CSVD患者的認(rèn)知功能障礙有關(guān)，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[32]。Syn是一種突觸前膜囊泡蛋白，在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中起重要作用，與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性密切相關(guān)，Syn的定量分析可推測(cè)突觸的密度和分布[33]。PSD-95是由許多動(dòng)態(tài)的蛋白復(fù)合體組成并附著于突觸后膜，可維持突觸連接，調(diào)控樹突棘形態(tài)及突出功能。本研究結(jié)果表明，模型大鼠海馬CA3區(qū)BDNF、Syn和PSD-95的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而給予尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量治療后，海馬CA3區(qū)BDNF、Syn和PSD-95的表達(dá)水平顯著升高，說明健腦解郁方可通過上調(diào)CSVDD大鼠海馬CA3區(qū)BDNF、Syn和PSD-95的表達(dá)改善突觸可塑性障礙，達(dá)到抗抑郁的療效。

本研究以尼莫地平、丁苯酞聯(lián)合氟西汀為陽性對(duì)照藥物，通過-半乳糖（400 mg/kg，8周）聯(lián)合BCAS和CUMS制備CSVDD大鼠模型，評(píng)估大鼠認(rèn)知功能及情緒變化，檢測(cè)血清中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、Glu、GABA及炎癥因子IL-6、TNF-α水平，觀察腦組織海馬CA3區(qū)血管周圍間隙病變及胼胝體髓鞘損傷情況，檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量和BDNF、Syn、PSD-95蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，健腦解郁方高劑量可改善模型大鼠認(rèn)知、情緒障礙，提升血清中5-HT、GABA水平及降低Glu水平，減輕海馬血管周圍間隙擴(kuò)大及胼胝體髓鞘損傷，減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡并上調(diào)BDNF、Syn、PSD-95蛋白表達(dá)。

綜上，鑒于海馬突觸可塑性對(duì)神經(jīng)功能的調(diào)控作用，結(jié)合本研究的結(jié)果，推測(cè)健腦解郁方可能通過促進(jìn)海馬突觸可塑性，提升神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給，降低海馬神經(jīng)元凋亡，以此改善腦組織海馬及白質(zhì)區(qū)域病理損傷，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的表達(dá)，改善CSVDD模型大鼠認(rèn)知及情緒障礙。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王伊龍, 陳瑋琪, 葉瑾怡, 等. 腦小血管病：回眸2022 [J]. 中國(guó)卒中雜志, 2023, 18(1): 17-41.

[2] 王香元, 佘瑞寧, 方銳, 等. 腦小血管病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及制備方法研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2022, 53(18): 5851-5860.

[3] Djernes J K. Prevalence and predictors of depression in populations of elderly: A review [J]., 2006, 113(5): 372-387.

[4] Abas M, Bowers T, Manda E,. Opening up the mind: Problem-solving therapy delivered by female lay health workers to improve access to evidence-based care for depression and other common mental disorders through the Friendship Bench Project in Zimbabwe [J]., 2016, 10: 39.

[5] Sheline Y I, Pieper C F, Barch D M,. Support for the vascular depression hypothesis in late-life depression: Results of a 2-site, prospective, antidepressant treatment trial [J]., 2010, 67(3): 277-285.

[6] Rensma S P, van Sloten T T, Launer L J,. Cerebral small vessel disease and risk of incident stroke, dementia and depression, and all-cause mortality: A systematic review and meta-analysis [J]., 2018, 90: 164-173.

[7] 魏樂, 黃欣怡, 唐中秋, 等. 海馬神經(jīng)元突觸可塑性在抑郁癥防治機(jī)制中的研究進(jìn)展 [J]. 湖北民族大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2021, 38(3): 73-76.

[8] Wong F C C, Yatawara C, Low A,. Cerebral small vessel disease influences hippocampal subfield atrophy in mild cognitive impairment [J]., 2021, 12(2): 284-292.

[9] Wang J X, Yang C Y, Wang H Y,. A new rat model of chronic cerebral hypoperfusion resulting in early-stage vascular cognitive impairment [J]., 2020, 12: 86.

[10] Pinter D, Ritchie S J, Doubal F,. Impact of small vessel disease in the brain on gait and balance [J]., 2017, 7: 41637.

[11] Shi Y L, Wardlaw J M. Update on cerebral small vessel disease: A dynamic whole-brain disease [J]., 2016, 1(3): 83-92.

[12] 劉春燕, 李勇, 唐茜茜. 腦小血管病患者認(rèn)知功能障礙與H型高血壓及腦血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)性分析 [J]. 神經(jīng)損傷與功能重建, 2021, 16(2): 86-89.

[13] 計(jì)暢, 楊云紅, 劉彬. 影響老年腦小血管病患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的危險(xiǎn)因素分析 [J]. 中國(guó)老年保健醫(yī)學(xué), 2020, 18(1): 44-47.

[14] 王祥翔, 柴湘婷, 譚蘭. 腦白質(zhì)改變發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué), 2016, 17(8): 97-100.

[15] Ishida N, Saito M, Sato S,. Mizagliflozin, a selective SGLT1 inhibitor, improves vascular cognitive impairment in a mouse model of small vessel disease [J]., 2021, 9(5): e00869.

[16] Hasan T F, Hasan H, Kelley R E. Overview of acute ischemic stroke evaluation and management [J]., 2021, 9(10): 1486.

[17] 初桂蘭, 辛玥, 程佶, 等. 神經(jīng)元型一氧化氮合酶在缺氧缺血新生大鼠腦組織的表達(dá)變化及其抑制劑7-NI的腦保護(hù)作用 [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 84(2): 156-158.

[18] Low A, Su L, Stefaniak J D,. Inherited risk of dementia and the progression of cerebral small vessel disease and inflammatory markers in cognitively healthy midlife adults: The PREVENT-Dementia study [J]., 2021, 98: 124-133.

[19] Jandke S, Garz C, Schwanke D,. The association between hypertensive arteriopathy and cerebral amyloid angiopathy in spontaneously hypertensive stroke-prone rats [J]., 2018, 28(6): 844-859.

[20] 趙洪慶, 韓遠(yuǎn)山, 柳卓, 等. 焦慮性抑郁模型大鼠腦區(qū)單胺遞質(zhì)含量與神經(jīng)因子表達(dá)的變化 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2017, 25(4): 373-379.

[21] Bak L K, Schousboe A, Waagepetersen H S. The glutamate/GABA-glutamine cycle: Aspects of transport, neurotransmitter homeostasis and ammonia transfer [J]., 2006, 98(3): 641-653.

[22] Madeira C, Vargas-Lopes C, Brand?o C O,. Elevated glutamate and glutamine levels in the cerebrospinal fluid of patients with probable Alzheimer’s disease and depression [J]., 2018, 9: 561.

[23] Luscher B, Shen Q, Sahir N. The GABAergic deficit hypothesis of major depressive disorder [J]., 2011, 16(4): 383-406.

[24] 王俊峰, 邢儀霞. 天鉤石膝湯對(duì)腦小血管病性認(rèn)知功能障礙患者炎癥因子及血腦屏障功能的影響[J]. 新中醫(yī), 2019, 51(12): 4.

[25] Maes M, Berk M, Goehler L,. Depression and sickness behavior are-faced responses to shared inflammatory pathways [J]., 2012, 10: 66.

[26] 劉遠(yuǎn)新. 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬CA3區(qū)HDAC2表達(dá)的影響 [J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 41(6): 655-657.

[27] 劉艷, 趙鳳麗, 周衛(wèi)東. 血管周圍間隙擴(kuò)大與腦小血管病關(guān)系研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2017, 24(6): 430-434.

[28] Hill R A, Grutzendler J. Uncovering the biology of myelin with optical imaging of the live brain [J]., 2019, 67(11): 2008-2019.

[29] Filley C M, Fields R D. White matter and cognition: Making the connection [J]., 2016, 116(5): 2093-2104.

[30] Tolahunase M R, Sagar R, Faiq M,. Yoga-and meditation-based lifestyle intervention increases neuroplasticity and reduces severity of major depressive disorder: A randomized controlled trial [J]., 2018, 36(3): 423-442.

[31] 曾九僧, 陳力, 彭希, 等. 逍遙散拆方藥隊(duì)醋酸乙酯部位抗抑郁作用的HPA軸-神經(jīng)可塑性關(guān)聯(lián)調(diào)控機(jī)制研究[J]. 中草藥, 2023, 54(11): 3534-3547.

[32] 陳妙, 周榮, 黃祖秀, 等. 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1水平與腦小血管病所致認(rèn)知功能障礙的關(guān)系 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2022, 32(21): 2623-2626.

[33] 馬小娟, 馮振宇, 趙杰, 等. 助陽開郁方對(duì)抑郁癥大鼠行為及海馬神經(jīng)可塑性的影響 [J]. 中藥材, 2018, 41(5): 1215-1219.

Effect of Jiannao Jieyu Formula on hippocampal synaptic plasticity in rats with cerebral small vessel disease related with depression

DAI Ling1, LUO Yan2, HOU Guang-han3, WANG Le2, LI Huan2, MENG Pan2

1. School of Pharmacy, Hunan Vocational College of Science and Technology, Changsha 410200, China 2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. The Forth Hospital of Changsha, Changsha 410200, China

To explore the intervention effect and mechanism of Jiannao Jieyu Formula (健腦解郁方) on hippocampal synaptic plasticity in rats with cerebral small vessel disease related with depression (CSVDD).Forty SHR rats were divided into model group, nimodipine (21.6 mg/kg) + butylphthalide (54 mg/kg) + flouxetine (5.4 mg/kg) group, Jiannao Jieyu Formula high-, medium-, low-dose (28.08, 14.04, 7.02 g/kg) groups, with eight rats in each group, and eight WKY rats were taken as control group. The rats were sc-galactose (400 mg/kg) on backs for eight weeks, combined with bilateral common carotid stenosis (BCAS) for four weeks and chronic unpredicted mild stress (CUMS) for four weeks to establish CSVDD model. The depression-like behavior of rats was evaluated by sugar water preference rate test, open field test, forced swimming test and water maze test; ELISA was used to detect nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1), 5-hydroxytryptamine (5-HT), glutamate (Glu), γ-aminobutyric acid (GABA), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels in serum of rats; Cerebral blood flow was observed by laser microcirculation blood flow imaging instrument; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the perivascular space in CA3 area of hippocampus; The pathological changes of corpus callosum in white matter of rats were observed by Prussian blue (LFB) staining; TUNEL method was used to detect neuronal apoptosis in CA3 region of hippocampus; Immunofluorescence method was used to detect the expressions of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), synaptophysin (Syn) and post synaptic density-95 (PSD-95) in CA3 region of hippocampus.Compared with model group, preference rate of sugar water in Jiannao Jieyu Formula group was significantly increased (< 0.05), autonomous activity was significantly increased (< 0.05), swimming immobility time was significantly reduced (< 0.05), and the escape latency and target quadrant latency were significantly shortened (< 0.05, 0.01). Cerebral blood flow was significantly increased (< 0.05, 0.01). The levels of 5-HT and GABA in serum were significantly increased (< 0.05), while the levels of NO, ET-1, Glu, IL-6 and TNF-α were significantly decreased (< 0.05, 0.01). The number of enlarged perivascular spaces in CA3 area of hippocampus was decreased, pathological damage and myelin sheath damage of corpus callosum were decreased. The number of apoptotic neurons in hippocampal CA3 area was significantly decreased (< 0.01), and the expressions of BDNF, Syn and PSD-95 were significantly increased (< 0.05, 0.01).Jiannao Jieyu Formula may improve the pathological damage in hippocampus and white matter area of brain tissue, regulate the expression of neuroendocrine indicators, and improve the cognitive and emotional disorders of CSVDD model rats by promoting the synaptic plasticity of the hippocampus, enhancing the nutrition supply of nerve cells, and reducing the apoptosis of hippocampal neurons.

Jiannao Jieyu Formula; cerebral small vessel disease related with depression; neuroplasticity; apoptosis; neuroendocrine; paeoniflorin; rehmannioside A; hypericin; crocin I; morroniside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5968 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.015

2023-04-26

長(zhǎng)沙市杰出創(chuàng)新青年培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（kq2009018）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（21C1190）；湖南省中醫(yī)藥科研課題（B2023021）；長(zhǎng)沙市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（kq2208471）；湖南省自然科學(xué)基金部門聯(lián)合項(xiàng)目（2023JJ60213）

戴 玲（1988—），女，碩士，講師，主要從事中藥藥理活性及中藥化學(xué)成分研究。Tel: 15874954751 E-mail: dailing-1988@163.com

孟 盼，女，博士，副研究員，主要從事神經(jīng)精神疾病的機(jī)制研究及防治。E-mail: 403642392@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]